《Small》：Nano-Optical Biomolecular Interaction Sensing Within Complex Media via Peptide Hybrid Ligand Conjugation
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蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）主导大多数生物学过程，并且在疾病中经常发生改变。然而，体外表征方法通常局限于结合亲和力测定、需要专门仪器，或者易受延伸表面伪影的影响。此外，许多方法仍与生理介质不兼容。基于纳米颗粒（NP）局部表面等离子体共振（LSPR）的纳米
蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）主导大多数生物学过程，并且在疾病中经常发生改变。然而，体外表征方法通常局限于结合亲和力测定、需要专门仪器，或者易受延伸表面伪影的影响。此外，许多方法仍与生理介质不兼容。基于纳米颗粒（NP）局部表面等离子体共振（LSPR）的纳米光学生物传感提供了一种有吸引力的溶液相替代方案，但其在复杂环境中的性能一直受到限制。在此，研究人员提出了一种基于等离子体纳米颗粒的溶液相光学平台，该纳米颗粒用可编程肽-杂合配体功能化。研究人员使用序列定义的配体，将纳米颗粒锚定、非特异性相互作用抑制和位点特异性生物偶联相结合。与传统聚合物不同，这些配体通过固相肽合成实现分子精度。研究人员展示了这种结构如何有效抑制非特异性吸附，同时保持胶体稳定性和光学性能，并可通过点击化学和Sortase介导的连接适应多种蛋白质靶标。该平台能够通过标准紫外-可见分光光度法（UV-vis）和最少样品量实现高灵敏度、无标记的PPI检测。研究人员直接在未稀释血清中定量低分子量蛋白质的结合亲和力，并在缓冲液中进行动力学分析。此外，研究人员展示了在缓冲液和血清中对多个蛋白质对的适用性，以及在人类血清中的概念验证检测和定量，突显了其未来诊断应用的潜力。
**研究背景与问题**
蛋白质-蛋白质相互作用（Protein–Protein Interactions, PPIs）是生物系统组织和调控的核心，大多数细胞功能并非由单个蛋白质独立完成，而是通过蛋白质与其他生物分子的相互作用来实现。这些相互作用控制着信号转导、基因调控、酶活性、免疫识别和细胞结构组织等多种过程。PPIs的紊乱与多种疾病相关，包括癌症、神经退行性疾病和传染病，因此PPIs是治疗干预的重要靶标。定量测量PPI参数——特别是结合亲和力、特异性和动力学——可提供重要的机制见解，并指导治疗药物的开发。然而，生物学相关的PPIs发生在复杂的生物环境中，因此开发兼容血清、细胞裂解液或全血等复杂生物流体的PPI传感器对于将PPI测量转化为临床和生物医学应用至关重要。
表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）长期被视为无标记测量蛋白质结合亲和力和动力学的行业标准。然而，传统SPR平台面临若干实际障碍，包括高昂的仪器成本、对专用微流控系统的依赖（易被血清蛋白堵塞）以及昂贵且有限重复使用的金属传感芯片的需求。此外，延伸平面表面的存在可能扰动分子的自然三维扩散，可能干扰结合测量的准确性。其他常用分析技术如等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry, ITC）、微量热泳动（Microscale Thermophoresis, MST）和荧光各向异性局限于测量平衡亲和力、灵敏度有限、样品要求严格或与复杂生物介质不兼容。核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）可提供独特的结合机制见解，但需要特定的样品制备和昂贵的高场仪器。生物层干涉术（BioLayer Interferometry, BLI）和光栅耦合干涉术（Grating-Coupled Interferometry, GCI）仍依赖昂贵的仪器和延伸平面表面。
作为更易获取且成本更低的替代方案，溶液相局部表面等离子体共振（Localized Surface Plasmon Resonance, LSPR）生物传感器已被开发。该传感原理利用贵金属纳米颗粒（Nanoparticles, NPs），其LSPR将电磁场限制并增强在纳米级近场传感体积内，实现高度局域化的分子检测。当生物分子进入这些体积时，它们引起局部折射率变化，导致LSPR消光光谱的偏移。利用高灵敏度的银-金核壳十面体纳米颗粒，可以检测分子量<15 kDa的蛋白质之间的相互作用。该方法的一个关键实际优势是这些光谱偏移可以用大多数实验室配备的标准紫外-可见分光光度计进行光度检测，同时由于纳米颗粒合成、功能化和测量所需的试剂和样品量极少，材料需求低。此外，纳米颗粒传感器在溶液中自由扩散，大多避免了源自延伸二维表面的伪影。
然而，由于纳米颗粒表面生物污染，在生理流体中保持结合选择性和灵敏度仍然是主要挑战。在这种环境中，高丰度蛋白质和其他生物分子通常吸附到NPs上，形成"生物分子冠"（biomolecular corona），可能掩盖目标信号。尽管最近取得了进展，现有方法在没有使用延伸表面的情况下，仍难以在血清中进行定量、无标记的PPI分析。研究人员的先前工作中，蛋白质固定到纳米生物传感器依赖于聚组氨酸标签（His tag）与功能化到纳米颗粒表面的Ni/NTA基团的配位。虽然方便、模块化且在缓冲液中有效，但该方法在血清等复杂生物介质中表现不佳。为实现此类环境中的纳米光学PPI传感，必须解决两个关键挑战：（1）最小化与血清蛋白的非特异性相互作用；（2）维持与目标蛋白质（Proteins of Interest, POI）及其结合伙伴的特异性相互作用。
在此，研究人员引入了一种策略，不是借用防污染文献中常见的聚乙二醇（Polyethylene Glycol, PEG）、聚两性离子和聚噁唑啉，而是借用肽合成。2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸（AEEA）是一种短的PEG样构建模块，常用于治疗性肽中，如替尔泊肽的侧链，或与肽核酸（Peptide Nucleic Acids, PNAs）一起作为柔性、可溶和生物相容的连接子。研究人员在此将其用作纳米颗粒表面配体以实现防污染，通过半胱氨酸末端硫醇连接实现与纳米颗粒金表面的锚定。虽然全肽两性离子配体可以提供有效的屏蔽，但它们对经典氨基酸的依赖也可能无意中引入天然的肽-蛋白质识别基序。研究人员的杂合设计通过利用聚(AEEA)间隔物作为主要屏蔽层来避免这一点，有效消除了隐身域内的氨基酸识别序列，同时将肽块严格限制在锚定和末端靶向位点。由于Cys-Poly(AEEA)完全通过固相肽合成（Solid-Phase Peptide Synthesis, SPPS）合成，它是单分散和序列定义的，避免了传统聚合物配体中固有的多分散性。这种结构将三种所需功能——表面锚定、防污染和远端生物偶联手柄——整合在单个配体序列中。原则上，使用精确的序列定义表面配体促进了批次间重现性和结合测定的定量解释，因为每个配体在分子上都是确定的。此外，聚(AEEA)长度、连接子间距和生物偶联基序（SPAAC兼容的叠氮化物、Sortase识别序列等）可以通过迭代SPPS设计独立优化——这是 Compared to 大多数聚合物变体更容易实现的优势。
研究人员开发并验证了一种高度特异性的溶液相纳米颗粒LSPR平台，具有序列定义的杂合肽配体，用于防污染和位点特异性、生物正交的蛋白质固定。该系统能够通过标准紫外-可见分光光度法在缓冲液和未稀释动物血清中可靠且定量地测定热力学和动力学结合参数。研究人员展示了多个蛋白质-蛋白质相互作用的特异性检测，包括内在无序蛋白质区域或小蛋白质（<15 kDa），以及直接在人类血清中定量确定浓度的目标分析物——解决了生物分析PPI传感中一个关键未满足的需求，并突显了该平台的临床和诊断潜力。论文发表在《Small》。
**关键技术方法**
研究人员采用固相肽合成（SPPS）制备序列定义的CysPoly(AEEA)杂合配体；利用自建光反应器合成银十面体纳米颗粒（AgDNP@Au）；通过菌株促进的叠氮-炔环加成（SPAAC）点击化学和Sortase介导的连接（SML）两种生物正交策略实现蛋白质的位点特异性共价固定；采用紫外-可见分光光度法监测LSPR光谱偏移；结合动态光散射（DLS）和ζ电位测量表征纳米颗粒；运用全原子分子动力学（MD）模拟研究配体刷的水合和蛋白质吸附行为；使用MALDI-TOF质谱确认偶联产物。人血清样本来源为商业获取。
**研究结果**
**抗污染杂合肽配体用于蛋白质-蛋白质相互作用传感**：研究人员比较了PEG800:NTA和CysPoly(AEEA)杂合配体功能化纳米颗粒在缓冲液和未稀释胎牛血清（FBS）中的传感性能。以PEX5-PEX14相互作用为模型系统，PEG800:NTA功能化纳米传感器在缓冲液中显示清晰的LSPR偏移，但在血清中无特异性结合信号。相比之下，CysPoly(AEEA)功能化NPs在转移到FBS时的初始LSPR偏移与仅由体折射率差异（ΔRI = 0.0099）预测的值密切匹配，表明血清蛋白吸附贡献可忽略。DLS测量显示PEG800:NTA涂层AgDNP@Au在FBS孵育和洗涤后流体动力学直径增加约15 nm，表明形成了稳定的"硬"蛋白质冠；而CysPoly(AEEA)功能化NPs显示约5 nm的可忽略尺寸变化，表明没有保留硬冠。MD模拟揭示CysPoly(AEEA)刷每链与周围水分子形成中位数11个氢键，而PEG800:NTA为8个，表明CysPoly(AEEA)具有更高的水合水平。此外，CysPoly(AEEA)配体在所有BSA取向上表现出显著更少的持久接触，且仅通过氢键介导，无离子相互作用。这些实验和模拟结果支持一个模型：血清蛋白非特异性吸附到纳米颗粒表面导致形成"硬"、相对不可渗透的蛋白质冠，可能通过与NTA等带电基团的相互作用，这种冠可以空间和静电阻碍NP表面结合位点的可及性。
**通过CysPoly(AEEA)配体模块化共价蛋白质连接到纳米传感器**：研究人员设计了两种不带电的CysPoly(AEEA)变体，具有不同的末端官能团，分别通过SPAAC点击化学和Sortase介导的连接实现蛋白质的位点特异性共价附着。对于SPAAC策略，研究人员在POI-1的C末端工程化半胱氨酸残基，与马来酰亚胺-DBCO连接子反应生成蛋白质-DBCO偶联物，然后与CysPoly(AEEA)配体C末端的叠氮化物通过1,3-偶极环加成反应形成稳定的1,2,3-三唑连接。对于SML策略，研究人员合成了带有C末端Sortase识别基序（LPETGGG）的CysPoly(AEEA)杂合配体，在Sortase4M催化下实现位点特异性共价固定。两种生物偶联策略均需先在溶液中将蛋白质与CysPoly(AEEA)配体预连接，然后再嫁接到纳米颗粒表面，因为直接在配体功能化NPs上进行偶联无效，这与 crowded 表面空间位阻限制反应性末端可及性的报道一致。最后使用较短的CysPoly(AEEA)配体进行回填，显著增强了纳米生物传感器的稳定性和防污染性能。成功偶联通过紫外-可见光谱确认，功能化后观察到等离子体共振峰的红移，流体动力学直径和ζ电位相对于未功能化和仅配体对照均增加。以生物素-链霉亲和素相互作用基准测试传感性能，测得检测限（LOD）为43 pM，与芯片和纤维基LSPR传感器报告的低皮摩尔范围相当，且显著优于其他胶体溶液相系统仅达到的低纳摩尔灵敏度。
**缓冲液中的PPI检测与定量**：研究人员使用CysPoly(AEEA)功能化NP生物传感器定量蛋白质-蛋白质相互作用。对于PEX52-PEX14相互作用对，通过SPAAC化学功能化，滴定产生符合Hill-Waud方程的结合曲线，表观KD为350 ± 51 nM。对照实验使用BSA作为POI-2或无固定化PEX52时未检测到结合。对于PEX51-PEX14结合对，PEX51通过SML固定在NP表面，滴定产生饱和的浓度依赖性响应，KD为330 ± 39 nM。动力学测量显示PEX52-PEX14的kobs = 0.141 ± 0.004 s?1，PEX51-PEX14的kobs = 0.231 ± 0.009 s?1，结合平衡解离常数计算出PEX52-PEX14的ka = (1.04 ± 0.05) × 10? M?1s?1、kd = (3.7 ± 0.4) × 10?2 s?1，PEX51-PEX14的ka = (1.7 ± 0.1) × 10? M?1s?1、kd = (5.7 ± 0.6) × 10?2 s?1。这些速率与先前报道一致。研究人员还测量了其他几个低分子量蛋白质-蛋白质相互作用对（6-14 kDa），包括TAD-NCBD、TAD-MDM2和ACTR-NCBD，使用两种生物偶联方法。在所有测试情况下，目标结合伙伴产生可测量的光谱偏移，而BSA对照显示可忽略的偏移，证明两种固定策略均可靠地支持缓冲液中多种PPIs的高特异性和最小非特异性污染检测。
**血清中的PPI检测与定量**：研究人员在未稀释FBS中定量PEX52-PEX14和PEX51-PEX14相互作用的平衡结合。纳米生物传感器在FBS中孵育1小时以允许NP表面平衡。紫外-可见光谱显示无纳米颗粒聚集证据。平衡结合等温线产生的表观KD与缓冲液中测量值相当（PEX52-PEX14：缓冲液350 nM vs. FBS 470 nM；PEX51-PEX14：330 nM vs. 320 nM），表明血清环境未显著扰动结合亲和力或传感器性能。与先前NTA-Ni-His-tag蛋白质固定策略在血清中传感受损不同，这里使用的功能化肽杂合配体提供了防污染界面同时允许特异性相互作用。研究人员还在未稀释FBS中测试了多个额外的蛋白质-蛋白质相互作用对（TAD-NCBD、TAD-MDM2、ACTR-NCBD、PEX51-PEX14、PEX52-PEX14），通过两种生物偶联技术。虽然信号幅度相对于缓冲液实验略有降低，但特异性PPI响应仍然容易检测，证明在复杂生物介质中对多种蛋白质对的稳健传感器性能。最后，为评估平台在临床相关环境中的诊断潜力，在稀释人类血清中进行测量。功能化纳米生物传感器引入含有已知浓度目标蛋白的血清中，所得LSPR偏移通过参考平行生成的结合滴定曲线转换为表观浓度。计算浓度与已知分析物水平显示良好一致性（PEX52-PEX14：500 nM vs. 1.4 μM；PEX51-PEX14：300 nM vs. 270 nM），证明两种生物偶联方法在复杂生物流体中的定量蛋白质检测能力。
**讨论与结论**
研究人员讨论了在人类血清中定量分析物回收受到若干变异来源的影响。与缓冲液和FBS测量不同，人类血清需要稀释，但残余散射仍导致独立制备的相同储备液等分试样之间的光学背景差异。提取偏移的准确性因此更多受到基质光学质量和异质性的限制，需要在未来临床部署前进行优化和校准。研究人员的平台在复杂生物环境中保持稳健性能，对未稀释血清中多个内在无序蛋白质对提供选择性和可检测的响应。即使在稀释人类血清中，已知浓度的目标分析物也通过结合滴定曲线被回收，证明了该方法的诊断潜力，同时表明基质相关的光学变异性仍有待解决以实现定量临床应用。尽管研究人员已在多个PPI对和环境中展示了纳米传感器功能，但性能仍可能依赖于蛋白质，因为固定化蛋白质的物理化学性质可影响非特异性吸附。因此，纳米传感器与其他蛋白质的兼容性全貌仍有待确定，可能需要针对每个蛋白质对和介质进行优化。尽管如此，防污染CysPoly(AEEA)杂合配体界面与多功能共价偶联策略的结合为生理相关条件下的诊断和生物分子相互作用研究提供了广泛适用的框架。
研究结论翻译：在这项工作中，研究人员引入了一种溶液相纳米颗粒光学生物传感平台，能够直接在复杂生物介质中定量、实时分析具有挑战性的蛋白质-蛋白质相互作用。利用固相肽合成的多功能性，研究人员采用序列定义的CysPoly(AEEA)配体，将三种功能——表面锚定、防污染和位点特异性生物偶联——整合在单个分子构建体中。这些配体大幅减少非特异性蛋白质吸附，并通过点击化学和酶连接实现模块化、共价和位点特异性的生物偶联。所得的纳米生物传感器能够在缓冲液和血清中可靠地检测和定量特异性蛋白质-蛋白质相互作用，与文献值良好一致，且不损害胶体稳定性。该平台操作简单，不需要昂贵或特殊的仪器，并且与常见缓冲液以及人类和动物血清兼容。模块化偶联化学使平台易于适应广泛的蛋白质靶标和相互作用系统。
