《Poultry Science》：Protocatechuic acid attenuates lipopolysaccharide-induced inflammatory responses in chicken macrophages by modulating the Toll-like receptor signaling pathway
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原儿茶酸（protocatechuic acid, PCA）具有抗炎和抗氧化活性。本研究旨在探讨PCA对脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的HD11细胞炎症反应的影响及其潜在作用机制。研究人员通过检测一氧化氮（nitric oxide
原儿茶酸（protocatechuic acid, PCA）具有抗炎和抗氧化活性。本研究旨在探讨PCA对脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的HD11细胞炎症反应的影响及其潜在作用机制。研究人员通过检测一氧化氮（nitric oxide, NO）、活性氧（reactive oxygen species, ROS）、炎症相关因子及蛋白表达，并结合转录组测序分析，系统评估了PCA对LPS诱导炎症反应的调控作用。结果表明，LPS刺激显著增加了HD11细胞中NO和ROS的产生，并上调了促炎细胞因子白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）和白细胞介素-8（interleukin-8, IL-8）的表达。相比之下，PCA处理降低了NO和ROS水平，下调了IL-1β、IL-6和IL-8的表达，并增加了白细胞介素-10（interleukin-10, IL-10）的表达。转录组分析显示，PCA调节了与先天免疫和炎症信号转导相关的基因及信号通路，包括Toll样受体（Toll-like receptor, TLR）信号通路。蛋白质印迹分析进一步证明，PCA显著降低了LPS诱导的Toll样受体4（TLR4）和髓样分化初级反应蛋白88（myeloid differentiation primary response 88, MyD88）的蛋白表达，以及下游炎症效应蛋白诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）和环氧合酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）的表达。综上所述，PCA有效缓解了LPS诱导的HD11细胞炎症反应和氧化应激，其抗炎作用可能涉及调节Toll样受体信号通路和抑制炎症效应蛋白的表达。本研究为阐明PCA对鸡源巨噬细胞炎症反应的调控作用提供了实验证据，并为其在禽类炎症调控中的进一步研究提供了参考。
研究背景与目的
炎症是机体应对病原微生物、有毒物质或组织损伤启动的一种重要的先天免疫防御机制。适当的炎症反应有助于清除有害刺激并维持体内稳态，但过度或持久的炎症反应会导致炎症介质过量产生，引发氧化应激、细胞损伤和组织功能障碍。巨噬细胞作为参与炎症反应的重要免疫细胞，在病原体识别和炎症介质释放中发挥关键作用。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌外膜的主要成分，能诱导巨噬细胞产生显著的炎症反应，因此被广泛用于建立体外炎症模型。HD11细胞是一种鸡源性巨噬细胞系，常用于研究禽类的炎症反应及其调控机制。
在家畜家禽生产中，病原感染是诱发炎症反应和组织损伤的主要因素之一。抗生素可通过抑制或杀灭病原菌来缓解细菌感染引起的炎症，但长期或不合理使用会促进耐药菌及耐药基因的出现和传播，同时带来药物残留、肠道菌群失调和公共卫生风险等问题。随着抗生素减量和限用政策的持续推进，开发改善宿主健康状态、调控炎症反应和氧化应激的非抗生素干预策略，已成为健康畜禽生产领域的重要研究方向。植物源生物活性化合物因其来源广泛、生物活性多样以及具有抗炎、抗氧化和免疫调节等特性而受到越来越多的关注。
原儿茶酸（PCA），又名3,4-二羟基苯甲酸，是一种天然酚酸类化合物，广泛存在于水果、蔬菜、谷物及多种药用植物中，也是花青素的重要代谢产物。PCA具有抗氧化、抗炎和细胞保护等多种生物活性，可通过调节氧化还原稳态和炎症信号来减轻病原刺激或应激引起的细胞损伤，因此在改善畜禽健康状况和减少抗菌药物依赖方面具有潜在应用价值。已有研究表明，PCA可通过调节氧化应激、炎症反应及相关信号通路，缓解LPS攻击仔猪的肠道屏障损伤、大肠杆菌诱导的肠上皮炎症和屏障功能障碍，以及镉诱导的大鼠大脑皮层损伤。在禽类中，PCA已被证实可通过调节Toll样受体4（TLR4）/p38和核因子κB（NF-κB）等信号通路，缓解热应激诱导的肉鸡肠道炎症。此外，PCA还能通过增强紧密连接蛋白如闭锁小带-1（ZO-1）和Claudin-1的表达，减轻沙门氏菌相关的肠道屏障损伤和炎症反应。然而，现有研究主要集中在整体动物和组织水平上观察PCA的作用效果，关于PCA对鸡源巨噬细胞炎症反应的调控作用及其对转录变化和相关信号通路的影响，尚缺乏充分的研究。因此，本研究旨在探讨PCA对LPS诱导的HD11巨噬细胞炎症反应的影响，并通过转录组分析和实验验证阐明其潜在的分子机制。
研究方法
研究人员采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法评估细胞活力；5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）检测法评估细胞增殖；乳酸脱氢酶（LDH）释放实验评估细胞膜损伤程度；利用Griess法和DCFH-DA荧光探针分别检测一氧化氮（NO）和活性氧（ROS）的水平；通过逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测炎症相关因子的mRNA表达水平；对正常对照组（NC）、LPS组和LPS+PCA组的HD11细胞进行RNA测序（RNA-seq）及生物信息学分析，包括差异表达基因（DEGs）筛选、基因本体论（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析；采用蛋白质印迹法（Western blot）检测TLR4、MyD88、iNOS和COX-2的蛋白表达水平；通过免疫荧光染色评估NF-κB p65的核转位情况；并使用TLR4选择性抑制剂TAK-242进行验证实验。
研究结果
LPS诱导炎症模型的建立及PCA安全浓度的确定：CCK-8结果显示，与NC组相比，1 μg/mL LPS刺激12 h可显著提高HD11细胞的代谢活性（P < 0.001），而RT-qPCR检测表明该条件下IL-1β mRNA表达水平最高，因此选定此条件建立炎症模型。单独使用50–1000 μM PCA处理对HD11细胞活力无显著影响，最终选用200、400和800 μM作为低、中、高剂量进行后续实验。
PCA缓解LPS诱导的HD11细胞增殖抑制和膜损伤：EdU染色显示，与NC组相比，LPS刺激显著减少了EdU阳性细胞数量，表明其抑制了细胞增殖；而高剂量PCA处理后增殖细胞数量增加。LDH释放实验表明，LPS刺激显著增加了LDH释放（P = 0.00645），而不同剂量的PCA均能显著降低LDH释放（P < 0.001），表明PCA减轻了LPS诱导的细胞膜损伤。
PCA减弱LPS诱导的炎症反应和氧化应激：RT-qPCR结果显示，LPS刺激显著上调了促炎细胞因子IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA表达，而PCA处理总体上降低了这些因子的表达，其中高剂量PCA显著抑制了IL-8表达。同时，LPS刺激也提高了抗炎细胞因子IL-10的mRNA表达，而PCA处理进一步提升了其表达水平。此外，LPS显著上调了编码iNOS和COX-2的NOS2和PTGS2基因的mRNA表达，而中、高剂量PCA显著降低了PTGS2表达，所有PCA处理组均显著降低了NOS2表达。ROS和NO检测结果表明，LPS刺激显著增加了HD11细胞内的ROS水平和NO产量，而PCA处理则降低了这两项指标。
PCA处理的HD11细胞转录组分析：RNA-seq分析发现，与NC组相比，LPS刺激共鉴定出4353个DEGs（上调2108个，下调2245个）。LPS+PCA组与LPS组比较，鉴定出719个DEGs（上调414个，下调305个）。进一步分析发现，有232个基因在LPS刺激后上调而在PCA处理后下调，另有209个基因在LPS刺激后下调而在PCA处理后恢复上调，表明PCA对LPS诱导的转录改变具有双向调控作用。
DEGs功能富集分析及关键通路的鉴定：KEGG富集分析显示，LPS上调而PCA下调的基因主要富集于免疫炎症反应相关通路，包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、IL-17信号通路、TNF信号通路、NF-κB信号通路、NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路、趋化因子信号通路、C型凝集素受体信号通路和JAK-STAT信号通路等。LPS下调而PCA上调的基因则主要富集于ABC转运蛋白、溶酶体、胆汁分泌等通路。基于上述结果，研究人员选择Toll样受体信号通路作为候选关键通路进行后续验证。
关键DEGs的RT-qPCR验证：选取IL-12β、EXFABP、ATF3和CCL4四个代表性DEGs进行RT-qPCR验证，其结果与RNA-seq表达趋势一致，证实了转录组数据的可靠性。
PCA通过调节Toll样受体信号通路缓解LPS诱导的炎症反应：Western blot结果显示，LPS刺激1 h后TLR4和MyD88蛋白表达达到峰值。与NC组相比，LPS刺激显著提高了TLR4（P = 0.0257）和MyD88（P = 0.0063）的蛋白表达水平，而PCA处理则显著降低了二者的表达。此外，LPS刺激还显著提高了iNOS（P = 0.0034）和COX-2（P < 0.001）的蛋白表达，PCA处理同样显著降低了它们的表达。
TAK-242对HD11细胞TLR4/MyD88信号的影响：使用TLR4选择性抑制剂TAK-242进行验证，结果显示，与LPS组相比，TAK、PCA+LPS、TAK+LPS和TAK+PCA+LPS各组中TLR4和MyD88的蛋白表达水平均显著降低（P < 0.05），进一步证实TLR4/MyD88信号参与了PCA对LPS刺激HD11细胞的调控作用。
PCA抑制LPS诱导的NF-κB p65核转位：免疫荧光染色显示，LPS刺激促进了p65从细胞质向细胞核的转位，而PCA处理则显著抑制了这一过程。定量分析表明，与NC组相比，LPS组p65核/质荧光强度比显著升高（P = 0.0244），而PCA处理则显著降低了这一比值（P = 0.008）。
讨论与结论
讨论部分指出，LPS刺激增强了HD11细胞的代谢活性但抑制了其增殖能力，这反映了巨噬细胞在炎症激活过程中的代谢重编程现象。PCA处理部分恢复了LPS诱导的增殖能力下降，表明其有助于维持炎症条件下巨噬细胞的功能稳态。PCA通过抑制iNOS和COX-2的表达，协调性地降低了NO、ROS及脂质炎症介质的产生，从而减轻了LPS诱导的炎症反应和氧化应激。在细胞因子方面，PCA不仅抑制了促炎因子IL-1β、IL-6和IL-8的表达，还进一步提升了抗炎因子IL-10的表达，显示出其纠正促炎/抗炎失衡的潜力。转录组分析揭示了PCA对LPS诱导的转录紊乱具有双向调控作用，并确认Toll样受体信号通路是关键靶点。进一步的蛋白和抑制剂实验证实，PCA通过抑制TLR4/MyD88表达及下游NF-κB p65核转位，从而减少炎症效应蛋白的表达。
研究结论：综上所述，PCA有效减轻了LPS诱导的HD11细胞炎症反应和氧化应激。PCA可能通过调节Toll样受体相关信号通路并抑制iNOS和COX-2的表达，从而减少炎症介质的产生，在鸡巨噬细胞中发挥抗炎保护作用。
