基于减毒Salmonella（SG）载体的BMP、GrpE与pMGA抗原细菌/宿主细胞双区室递送实现对鸡毒支原体与鸡白痢沙门菌的二价保护

《Poultry Science》：Bacterial and host cell-specific delivery of BMP, GrpE, and pMGA antigens via attenuated Salmonella confers bivalent protection against Mycoplasma gallisepticum and Salmonella Gallinarum in chickens

Mycoplasma gallisepticum（鸡毒支原体）与Salmonella Gallinarum（SG，鸡白痢沙门菌）是影响家禽生产的重要经济性细菌病原，但目前尚无单一疫苗可同时应对这两种病原。研究人员基于双表达质粒pJHL270构建了重组SG疫苗株JOL3203，整合功能上相互独立的原核与真核表达盒，以单一免疫程序递送两种互补的Mycoplasma gallisepticum抗原。细菌表达盒由Ptrc启动子驱动，表达源自BMP、GrpE、pMGA1.2与pMGA1.3蛋白保守B细胞、MHC I类及MHC II类表位的多表位嵌合抗原；宿主细胞表达盒由CMV启动子驱动，表达由BMP家族蛋白N端400个残基、GrpE C端250个残基及pMGA免疫优势表位构成的结构域融合抗原。该双表达策略旨在通过外源性与内源性加工途径促进抗原呈递，从而激发互补的CD4+与CD8+ T细胞应答。计算机（in silico）分析预测其具有高抗原性、良好结构质量及与鸡TLR2-2的强相互作用。Western blotting证实细菌裂解物中于32 kDa、感染鸡骨髓源巨噬细胞中于83 kDa处表达，RT-PCR验证了转录。安全性评价中JOL3203实现100%存活，而野生型SG组死亡率为83%，且系统播散与组织病理学变化轻微。免疫接种诱导了强健的Mycoplasma特异性系统性IgY、黏膜IgA、CD4+与CD8+ T细胞群扩增、MHC I类与II类表达上调，以及IFN-γ、TNF-α与IL-4的平衡Th1/Th2细胞因子谱。气管内攻毒后，免疫鸡经变色单位（CCU）试验显示气管定植显著降低、黏膜增厚减轻，平均日增重较PBS对照改善。JOL3203对致死性SG攻毒进一步提供100%存活，而PBS对照死亡率为75%，肝脾细菌载量显著降低。这些结果表明，pJHL270双表达平台为同时防御Mycoplasma gallisepticum与SG提供了安全有效的策略，并支持其作为家禽模块化活载体疫苗平台的更广泛应用。

研究背景：家禽生产持续受到细菌感染的制约，其中Mycoplasma gallisepticum（鸡毒支原体）引起慢性呼吸道病与生产损失，Salmonella enterica serovar Gallinarum（SG，鸡白痢沙门菌）引起禽伤寒，表现为肝脾病变、高死亡率与严重经济损失。两者在商业与散养体系中持续流行。现有Mycoplasma防控依赖严格生物安全、维持无Mycoplasma种鸡群与疫苗接种；F株、K株、ts-11、ts-304、6/85等活疫苗及灭活菌苗可减轻病情，但保护不一致、效力波动、存在残余毒力或生产性能与产蛋量下降等代价，免疫鸡仍可能携带或排出野毒株。减毒Salmonella可侵入抗原呈递细胞、激活天然免疫并表达异源抗原，是通用抗原递送载体；双表达系统可同时在细菌载体与宿主细胞中产生抗原，从而调动互补的抗原加工途径。为此，研究人员构建了基于pJHL270双表达SG疫苗平台，同时递送两种理性设计的Mycoplasma gallisepticum抗原，以检验活Salmonella载体能否诱导协同的体液与细胞免疫并对鸡毒支原体与禽伤寒提供二价保护。

主要关键技术方法（不超过250字）：研究采用免疫信息学表位预测（BepiPred 2.0、VaxiJen v2.0）、同源建模（SWISS-MODEL）与结构质量评估（PROCHECK、ProSA-web）、蛋白-蛋白对接（HDOCK，靶标鸡TLR2-2）及溶解度预测（Protein-Sol）；构建Ptrc驱动原核表达盒与CMV驱动真核表达盒的双表达质粒pJHL270并电转化减毒SG株；以Ni-NTA纯化重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体，经Western blotting与RT-PCR验证表达与转录；安全性评价采用4周龄雌性Brown Nick蛋鸡（韩国Pyeongtaek，联合孵化场），Mycoplasma攻毒试验在菲律宾Central Philippine University使用当地土鸡，两批攻毒使用独立鸡群。

研究结果：

In silico设计及双抗原疫苗构建体的结构验证：线性B细胞表位预测显示两构建体均保留多个评分>0.5的免疫原区；Ramachandran分析显示优势区残基分别为96.5%与98.6%，ProSa-web Z值为-1.72与-8.69；VaxiJen评分为1.2253与0.6140，均判为可能抗原；Protein-Sol可溶性值为0.462与0.696；对接显示结构域融合构建体与鸡TLR2-2结合更强（最佳对接分-294.20，置信度0.947），多表位构建体为-227.12至-203.55、置信度0.7448-0.8238，提示两者具良好结构特征与抗原性并可增强天然免疫识别。

双表达质粒与重组疫苗株的构建：经PCR、酶切与Sanger测序确认两个表达盒正确插入与方向，重组质粒电转化减毒SG株获得JOL3203，空载体获得对照株JOL3193。

Western blot验证Mycoplasma抗原表达：JOL3203中检出预期32 kDa原核表达条带，感染骨髓源巨噬细胞中检出83 kDa真核表达条带，载体对照无相应条带。

重组克隆确认与体外抗原转录：RT-PCR在重组Salmonella中检出多表位嵌合抗原转录本、在感染巨噬细胞中检出结构域融合抗原转录本，分别证实Ptrc与CMV启动子驱动的转录。

重组SG株在鸡体内的安全性：JOL422接种鸡进行性临床恶化，而JOL3193与JOL3203组保持稳定；重组株脾、肝细菌回收与泄殖腔排菌显著降低；14天内JOL422组死亡率83%，重组株组全部存活。

重组SG株的细胞毒性：PK-15细胞中JOL422引起广泛细胞死亡与单层破坏，重组株死亡细胞明显更少、形态保持更好。

组织病理学损伤评价：JOL422组脾结构破坏与炎症病变、肝脏病理改变明显，重组株仅见轻度或极轻微组织学变化。

重组疫苗株诱导的Mycoplasma特异性免疫应答：免疫后14与28天血清IgY与泄殖腔黏膜IgA显著高于PBS组；PBMC刺激指数显著升高；CD4⁺与CD8⁺ T细胞频率显著增加；MHC I类与II类表达显著上调；IFN-γ、TNF-α与IL-4表达显著升高，提示Th1/Th2平衡应答。

SG株诱导的Salmonella特异性免疫应答：JOL3193与JOL3203组血清IgY与黏膜IgA在14与28天显著高于PBS组；SG特异性淋巴细胞增殖显著增强；CD4⁺与CD8⁺ T细胞群显著增加；IFN-γ、TNF-α与IL-4显著上调。

对Mycoplasma gallisepticum攻毒的保护效力：JOL3203组临床症状明显减轻、无死亡；气管定植（CCU）显著降低，平均及最厚气管黏膜厚度显著减小，平均日增重显著提高，组织病理学证实黏膜增厚减轻。

对SG攻毒的保护效力：JOL3193与JOL3203组14天内全部存活，PBS组死亡率75%；攻毒后7天肝脾细菌载量显著低于PBS组；PBS组出现肝肿大伴变色与脾肿大等严重病变及脾、肝、盲肠广泛病理损伤，免疫组组织结构基本保持。

讨论部分总结：研究证明双表达Salmonella平台可在保持减毒载体安全性与保护力的同时递送互补的Mycoplasma gallisepticum抗原，实现区室特异性表达，激发协同的体液与细胞免疫。多表位构建体集中保守免疫决定簇以提高表位密度，结构域融合抗原则保留支持构象表位识别的较大结构区；作者亦指出多表位构建体3.4%残基位于不允许区、略高于高置信模型通常建议的<2%阈值，解读下游预测时需注意。Ptrc驱动细菌内表达、裂解后利于MHC II类呈递激活CD4⁺ T细胞；细菌被吞噬后质粒进入宿主细胞胞质，CMV驱动内源表达经MHC I类呈递激活CD8⁺ T细胞。安全性方面重组株系统播散与排菌显著减少、存活完全、细胞毒性与组织病理轻微；免疫原性方面系统性IgY、黏膜IgA、PBMC增殖、CD4⁺/CD8⁺扩增、MHC I/II上调与Th1/Th2细胞因子谱共同支持平衡应答；攻毒试验中气管定植与黏膜增厚降低、增重改善，SG攻毒完全存活且肝脾载量降低。研究结论：pJHL270双表达平台为同时防御Mycoplasma gallisepticum与SG提供了安全有效的策略，并支持其作为家禽模块化活载体疫苗平台的更广泛应用。