比较转录组揭示鸭抗鸭疫里默氏杆菌的品种特异性铁死亡与核糖体特征

《Poultry Science》：Comparative Transcriptomics Reveals Breed?Specific Ferroptosis and Ribosomal Signatures Associated with Riemerella anatipestifer Resistance in Ducks

鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer，RA）是造成鸭产业重大经济损失的主要病原体。阐明调控RA感染差异易感性与抗性的机制对于制定有效的疾病控制策略至关重要。本研究比较了两个遗传背景不同的鸭品种——商业化白卡鸭（White Kaiya，WK）与地方品种吉安红毛鸭（Ji'an Red-feathered，JR）——对RA攻毒的转录组反应。每个品种均包含抗性（resistant，R）与易感（susceptible，S）个体，分别命名为R-JR、S-JR、R-WK和S-WK组。GO与KEGG富集分析揭示，铁死亡（ferroptosis）通路在S-JR、R-WK和S-WK组中显著富集（P < 0.05），而在R-JR鸭中未观察到显著富集（P = 0.6936）。RT-qPCR证实，S-JR鸭表现出促铁死亡基因（TF、TFRC、PTGS2、SLC7A11）上调及铁输出基因SLC40A1下调，而这些基因在R-JR鸭中维持在基础水平。在WK鸭中，SLC40A1在R和S个体中均下调，且促铁死亡基因在S-WK鸭中表现出更强的上调。此外，核糖体与B细胞受体信号在R-JR鸭中特异性富集。包括内质网（ER）蛋白质加工、蛋白酶体、氧化磷酸化、细胞周期及多种生物合成/代谢通路在内的14条通路在所有组中普遍激活，而5条通路（MAPK、ABC转运蛋白、PI信号、Notch、Hedgehog）普遍下调。研究人员进一步验证了四个易感候选基因（SELE、ADAMTS4、IL8和IL6），其在两个品种的易感鸭中均上调。TUNEL染色显示易感组中TUNEL阳性信号增加，而抗性鸭的信号水平与对照组相当。总体而言，本研究为品种特异性RA抗性提供了新的分子证据，并强调铁死亡、核糖体及细胞死亡通路作为水禽选择性育种与治疗开发的潜在靶点。

研究背景：鸭产业在全球范围内快速扩张，中国占全球鸭肉产量的80%以上。然而集约化养殖促进了传染病的出现与传播，其中鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer，RA）感染是全球范围内影响鸭的最具经济破坏性的细菌性疾病之一。RA是传染性浆膜炎的病原，以纤维素性多发性浆膜炎、脑膜炎和败血症为特征，常在临床症状出现后24–48 h内致死。尽管抗生素和商业疫苗广泛使用，但多重耐药菌株的快速出现及RA广泛的血清型多样性（至少21种血清型，交叉保护有限）持续削弱防控效果。因此，解析宿主防御机制并开发抗病育种策略作为化学与免疫干预的可持续替代方案迫在眉睫。家禽基因组学已取得相当进展，但鸭对RA感染抗性的分子基础仍知之甚少。比较转录组学已成为解析宿主抗感染性疾病分子机制的有力手段，然而聚焦于鸭RA感染的转录组研究稀缺，尚无系统的比较分析来 delineate 品种与表型特异性的RA抗性转录特征。研究团队于2025年建立了两种遗传背景不同鸭品种——商业化白卡鸭（White Kaiya，WK）与地方品种吉安红毛鸭（Ji'an Red-feathered，JR）——的实验性RA感染模型，前期研究发现感染WK鸭全部出现病理性铁蓄积而R-JR鸭未出现，提示品种特异性铁稳态可能决定抗性。铁失调与铁死亡（ferroptosis，一种铁依赖的非凋亡性 regulated cell death，由脂质过氧化驱动）日益关联，但铁死亡在鸭RA抗性中的作用尚未被探索。

研究内容与结论：本研究旨在全面表征两个品种抗性与易感鸭在RA感染后脾脏（铁储存的主要器官和关键免疫组织）的转录组景观。通过整合转录组数据与先前获得的表型与免疫学数据，识别区分抗性与易感鸭的核心差异表达基因（DEGs）与富集通路，特别关注铁死亡与核糖体相关通路。研究结果表明，铁死亡通路缺乏显著富集、核糖体/翻译相关基因上调、细胞死亡相关通路的调控以及保守的蛋白质稳态转录程序共同促成鸭对RA的抗性。这些发现为宿主-病原互作提供了分子见解，并强调细胞死亡通路与核糖体功能作为水禽遗传选择与治疗干预的潜在靶点。重要意义在于建立了阐释品种特异性RA抗性的分子框架，揭示了用于标记辅助选择性育种的候选基因，并促进鸭产业RA可持续控制策略的开发。

关键技术方法：研究人员采集208只1日龄健康WK鸭和222只1日龄健康JR鸭（均RA未感染），4周龄时以足垫注射0.5 mL含1.0×10⁶ CFU的RA-YM菌株悬液，对照组注射等体积PBS；感染后72 h将无症状鸭归为抗性组、濒死鸭归为易感组。采用TRIzol法提取脾脏总RNA，经Agilent 2100检测质量后，用Illumina NovaSeq 6000平台进行150 bp双端测序；原始reads经质控后用HISAT2比对参考基因组（ncbi_anas_platyrhynchos_gcf_015476345_1_zju1_0），DESeq2筛选DEGs（|log₂ fold change| > 1且校正P < 0.05），并进行GO、KEGG与GSEA分析；RT-qPCR以GAPDH为内参验证基因表达；TUNEL法检测脾脏组织凋亡。

研究结果：
Overview of RNA-seq：RNA-seq文库共获得137.1亿原始reads，平均每文库4569万条，质控后保留约134.2亿reads，Q20为97.03%–98.24%，Q30为91.9%–94.59%，比对率为73.33%–83.59%。以|log₂ fold change| > 1且P < 0.05为标准，R-JR vs Ctl-JR鉴定出5075个DEGs（2724上调、2351下调），S-JR vs Ctl-JR鉴定出7265个DEGs（3584上调、3681下调），R-WK vs Ctl-WK鉴定出5069个DEGs（2723上调、2346下调），S-WK vs Ctl-WK鉴定出6884个DEGs（3590上调、3294下调）。Venn分析显示品种内抗性与易感组分别共享3350个（JR）和3573个（WK）共同DEGs；跨品种抗性组共享1426个上调基因、易感组共享2302个上调基因；三向Venn分析显示684个基因仅在R-JR组特异性上调。

Gene Ontology (GO) Enrichment Analysis：R-JR组上调基因富集于翻译、肽代谢/生物合成、DNA复制等BP条目，核糖体、核糖核蛋白复合体等CC条目，以及核糖体结构成分、RNA结合等MF条目；S-JR组上调基因富集于核糖体生物发生、蛋白质/肽/酰胺转运等。WK背景中R-WK与S-WK组上调基因富集谱相似，以离子跨膜转运、内膜系统、肽酶/蛋白酶体复合体为主。下调基因方面，R-JR与S-JR组均抑制小GTPase、Rho、Ras介导的信号转导及多种发育过程；R-WK组独特抑制转录调控相关BP条目；S-WK组主要抑制翻译与蛋白质修饰。抗性组共享上调基因富集于细胞分裂、蛋白质折叠、染色体分离、有丝分裂细胞周期与DNA复制；易感组共享上调基因富集于ER-高尔基体囊泡介导转运、蛋白质折叠、炎症反应与DNA损伤应答；R-JR组独特上调基因富集于翻译、胞质翻译、翻译延伸、凋亡过程、适应性免疫应答与B细胞受体信号，CC涉及核糖体亚基与核糖核蛋白复合体，MF包括核糖体结构成分及RNA、GTP、rRNA结合活性。

KEGG Pathway Enrichment Analysis：上调基因中，14条通路在所有四组中共同富集，包括ER蛋白质加工、蛋白酶体、氧化磷酸化、细胞周期、核苷酸糖/氨基酸生物合成、N-糖基化生物合成、碳代谢、糖酵解/糖异生、TCA循环、类固醇生物合成、氨酰-tRNA生物合成与蛋白质输出。成对比较显示R-JR与S-JR共享剪接体、核糖体生物发生、线粒体自噬、RNA降解、泛素介导的蛋白水解与mRNA监控等6条通路；R-WK与S-WK共享一碳池叶酸、脂肪酸代谢与乙醛酸/二羧酸代谢；R-JR与R-WK共享丙酮酸代谢、半胱氨酸/甲硫氨酸代谢与错配/碱基/核苷酸切除修复；S-JR与S-WK共享细胞因子-细胞因子受体互作与嘧啶代谢。下调基因中，5条通路在所有四组中共同抑制，包括MAPK信号、ABC转运蛋白、磷脂酰肌醇信号、Notch信号与Hedgehog信号。值得注意的是，铁死亡、氨基糖与核苷酸糖代谢及谷胱甘肽代谢在S-JR、R-WK和S-WK中显著富集，但在R-JR中未显著富集；R-JR独特富集核糖体、细菌侵袭上皮细胞、核质转运、内吞、RNA降解与剪接体。

RA Infection Triggers Apoptosis in Spleen Tissues of Susceptible ducks：TUNEL染色显示，JR和WK两个品种的易感鸭脾脏TUNEL阳性细胞数显著高于抗性鸭和未感染对照，而抗性组与对照组无显著差异。

RT-qPCR Confirmation of RNA-seq Data：选取8个铁死亡相关DEGs（SLC40A1、TF、TFRC、GSS、GPX4、ACSL4、PTGS2、SLC7A11）进行RT-qPCR验证。S-JR组中TF、TFRC、PTGS2、SLC7A11显著上调，SLC40A1显著下调，而R-JR组这些基因维持不变或轻微下调；WK背景中S-WK组TF、TFRC、GPX4、PTGS2、SLC7A11显著上调而R-WK组不变，SLC40A1在S-WK与R-WK组均显著下调。RT-qPCR结果与测序数据总体一致，证实了RNA-seq的可靠性。

Identification of Candidate Genes Associated with susceptibility to RA infection：通过Venn图筛选品种内抗性与易感组表达模式相反的基因，JR鸭中25个基因在R-JR上调而在S-JR下调、22个基因呈相反模式；WK鸭中2个基因在R-WK上调而在S-WK下调、28个基因呈相反模式。整合差异表达倍数、统计显著性、功能注释与文献综述，选取4个易感候选基因（SELE、ADAMTS4、IL8、IL6）和1个抗性候选基因（DNASE1L3）。RT-qPCR验证证实易感候选基因在R组下调或不变而在S组显著上调，抗性候选基因呈相反模式。

讨论部分总结：本研究整合转录组分析、RT-qPCR验证与TUNEL染色，阐明商业化WK鸭与地方JR鸭品种及表型特异性RA抗性的分子基础。研究发现，铁死亡通路缺乏显著富集、核糖体/翻译相关基因上调及品种特异性转录重编程是抗性相关的候选转录特征。所有四组中RA感染共同上调14条核心通路（ER蛋白质加工、蛋白酶体、氧化磷酸化、细胞周期及多种生物合成/代谢通路），反映有效免疫应答所需基本细胞机制的激活；共同下调5条通路（MAPK、ABC转运蛋白、PI信号、Notch、Hedgehog），可能代表生长相关信号的全局抑制以节约能量并重定向资源用于即时防御。品种特异性差异方面，R-JR鸭主要上调B细胞受体信号、适应性免疫应答及GTPase/Rho/Ras介导的信号转导，伴随核糖体通路激活；核糖体机制上调可能为强劲的免疫球蛋白分泌提供生物合成能力，小GTPase信号抑制可能限制细菌内化、限制过度炎症细胞迁移并促进活化B细胞在淋巴组织中的滞留。WK鸭主要上调铁死亡、离子跨膜转运、内膜系统组分与蛋白酶体相关通路，同时独特抑制转录调控程序，此策略似不足以阻止RA感染。抗性组（R-JR与R-WK）共享细胞周期、蛋白质折叠与DNA复制相关通路的上调，提示无论品种如何，抗性个体均 Mount 以蛋白质稳态与细胞周期进程为中心的保守细胞应答；易感组（S-JR与S-WK）共享炎症反应、DNA损伤应答与p53介导信号转导的上调，提示未消退的炎症伴随基因组损伤与p53驱动的应激应答。候选基因分析进一步强化了抗性与易感的区分：SELE介导白细胞黏附与外渗，ADAMTS4参与细胞外基质降解与炎症级联，IL8与IL6为促炎细胞因子，这些基因在兩個品种的易感个体中均上调，提示高炎症反应是RA感染易感的标志。最显著的观察是铁死亡通路激活在四组间差异明显：RA是血红素合成缺陷菌，完全依赖宿主来源铁进行生长与致病；本研究中铁死亡通路在S-JR、R-WK和S-WK中显著富集而在R-JR中不富集，与前期发现感染WK鸭全部出现病理性铁蓄积而R-JR鸭未出现相一致；RT-qPCR证实S-JR鸭促铁死亡基因上调而铁输出基因SLC40A1下调，反映铁摄取增强、外排受损与铁死亡易感性增加，而R-JR鸭维持这些基因于对照水平，反映主动的铁稳态。WK背景中SLC40A1在S-WK与R-WK均下调，证实该品种存在独立于抗性表型的固有铁输出缺陷，但促铁死亡基因上调在S-WK中明显强于R-WK，解释了易感WK个体更严重的组织损伤与死亡。此外，TUNEL染色显示两个品种易感个体TUNEL阳性细胞显著多于抗性鸭和未感染对照；但TUNEL检测DNA片段化无法区分凋亡与其他细胞死亡形式，观察到的DNA损伤可能源于凋亡、铁死亡或其联合效应；研究人员推测凋亡与铁死亡可能协同、叠加或独立介导易感宿主脾脏组织损伤，但需额外标志物分析或抑制剂实验来解析其相对贡献。研究局限性在于候选基因与通路的功能作用尚待验证，计划在鸭原代细胞中开展功能获得与缺失实验、铁死亡药理阻断（Fer-1或铁螯合剂）及核糖体与B细胞受体信号通路的抑制剂/激活剂与敲低实验，上游调控网络尤其是驱动核糖体与B细胞信号激活的转录因子亦需进一步研究。研究结论翻译：总之，本研究表明铁死亡通路缺乏显著富集、核糖体/翻译相关基因上调、细胞死亡相关通路的调控以及保守的蛋白质稳态转录程序共同促成鸭对RA的抗性。这些发现为宿主-病原互作提供了分子见解，并强调细胞死亡通路与核糖体功能作为水禽遗传选择与治疗干预的潜在靶点。