《International Journal of Genomics》：Cross-Cohort Transcriptomic and Oral Microbiome Analyses Identify Ferroptosis-Associated Signatures in Periodontitis and Oral Squamous Cell Carcinoma
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中文摘要翻译
背景：牙周炎（PD）与口腔鳞状细胞癌（OSCC）已被证实在炎症、口腔微生物改变及铁/氧化还原生物学方面存在关联。然而，铁死亡（ferroptosis）相关表达模式是否在独立采样的牙周与癌症队列间存在重叠仍不确定。研究人员在不假设现有数据集代表匹配
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背景：牙周炎（PD）与口腔鳞状细胞癌（OSCC）已被证实在炎症、口腔微生物改变及铁/氧化还原生物学方面存在关联。然而，铁死亡（ferroptosis）相关表达模式是否在独立采样的牙周与癌症队列间存在重叠仍不确定。研究人员在不假设现有数据集代表匹配个体或时间性疾病进程的前提下，对上述模式进行了表征。
方法：研究人员分析了牙龈单细胞RNA测序数据（GSE171213）、OSCC发现表达队列（GSE30784）以及独立的口腔舌鳞状细胞癌验证队列（GSE13601）。牙周微生物功能基因谱（GSE54290）及一项跨研究OSCC 16S丰度资源被分别分析。分析内容包括细胞注释、KEGG铁死亡基因集评分、样本及细胞类型水平比较、差异表达分析、外部转录组特征验证、微生物多样性与丰度分析，以及脂多糖（LPS）刺激的细胞系RT-qPCR和ELISA检测。转录组与微生物队列在个体患者水平上并未关联。
结果：质控后保留来自12个牙龈样本的34,342个细胞（四个健康对照[HCs]、五个PD、三个治疗后牙周炎[PDT]），归为11个注释细胞群。样本水平平均铁死亡基因集评分在HC为0.081、PD为0.114、PDT为0.076；这些描述性评分并不衡量铁死亡性细胞死亡。SAT1在细胞类型伪批量（pseudobulk）分析中显示PD相对于HC的正向关联（log2倍数变化，0.546；错误发现率[FDR]，0.012），并在全部三个转录组队列中呈现正向效应。一个源自发现队列的铁死亡相关OSCC特征在GSE13601中达到0.933的受试者工作特征曲线下面积（AUC）。牙周功能谱分析鉴定出25个晚期PD相关注释（FDR < 0.05），包括亚铁螯合酶信号降低。跨研究OSCC微生物组分析在项目校正后鉴定出293个诊断相关特征；项目留出分类的AUC为0.674。在脂多糖刺激后，GPX4、SLC7A11和FTH1在mRNA及蛋白水平升高，而ACSL4在牙龈成纤维细胞和THP-1来源巨噬细胞中降低。
结论：独立采样的牙周和OSCC队列显示铁死亡相关的转录组变化，其中SAT1作为跨队列候选基因浮现。并行的微生物数据集鉴定出疾病相关的功能基因和分类学差异，但并未证明患者体内的宿主-微生物相互作用或因果中介效应。LPS暴露的细胞系测量显示所选铁死亡相关标志物的表达变化，而非铁死亡性细胞死亡或功能性抵抗。这些结果为探索性关联；在缺乏直接铁死亡检测、配对纵向队列和前瞻性临床验证的情况下，不能确立疾病进展机制、临床可用生物标志物或治疗有效性。
论文解读
一、研究背景与目的
牙周炎（periodontitis, PD）是一种常见的慢性炎症性疾病，可进行性破坏牙周支持组织并导致牙齿脱落，2010年全球严重牙周炎的年龄标准化患病率估计为11.2%。该病涉及牙龈、牙周膜、牙骨质和牙槽骨，与龈下生物膜失调及宿主免疫反应紊乱密切相关。口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）作为口腔最常见的恶性肿瘤，其发生发展与慢性炎症和口腔微生态改变存在潜在关联。
铁死亡（ferroptosis）是一种新发现的调节性细胞死亡形式，以铁依赖性脂质过氧化为特征，区别于凋亡、坏死和自噬。GPX4作为铁死亡的核心负调控因子，通过还原脂质氢过氧化物发挥保护作用；SLC7A11编码的胱氨酸/谷氨酸反向转运体为谷胱甘肽合成提供原料；FTH1参与铁储存，ACSL4则影响脂质组成和铁死亡易感性。已有研究提示铁死亡相关通路与炎症和组织损伤存在联系，但牙周炎和口腔癌中铁死亡相关表达模式是否在独立队列间存在重叠尚不明确。
现有研究存在几个关键问题：第一，牙周炎和OSCC的关联多基于观察性研究，无法确立因果关系；第二，铁死亡基因集评分仅反映通路相关基因的相对表达，不能直接证明铁死亡性细胞死亡；第三，转录组与微生物组数据往往来自不同个体，缺乏患者层面的匹配；第四，牙周炎向口腔癌进展的时间序列尚无法在横断面数据中重建。因此，研究人员开展了一项多队列、多组学的整合分析，旨在表征牙周炎和OSCC中铁死亡相关基因表达模式及口腔微生物特征，为后续机制研究提供假设基础。
二、主要技术方法
研究人员使用了多项关键技术方法。转录组分析方面，对GSE171213牙龈单细胞RNA测序数据进行了质控、标准化、高变基因筛选、主成分分析、UMAP降维和Leiden聚类，并基于典型标志物进行细胞类型注释；利用Scanpy的匹配对照基因评分程序计算KEGG hsa04216铁死亡基因集评分；在细胞类型水平进行PD与HC的Welch检验及FDR校正；对GSE30784（GPL570平台，167例OSCC、17例发育不良、45例对照）和GSE13601（GPL8300平台，31例原发肿瘤、26例正常组织）表达矩阵进行差异表达分析和铁死亡特征构建与外部验证。微生物组分析方面，对GSE54290牙周HuMiChip功能基因谱（12例健康、12例中度PD、13例晚期PD）进行log2转换和差异丰度分析；对跨研究OSCC 16S丰度表（494例OSCC、393例HC、172例口腔潜在恶性疾病，来自13个项目）进行ConQuR校正、中心对数比（CLR）转换和项目校正的线性模型分析，并采用项目留出的分层分组交叉验证评估分类性能。此外，还进行了牙龈成纤维细胞和THP-1来源巨噬细胞的LPS刺激实验，通过RT-qPCR和ELISA验证铁死亡相关标志物的表达变化。
三、研究结果
3.1 牙龈细胞图谱解析疾病相关的免疫和基质区室变化
质控后保留34,342个细胞，注释为11个细胞群：B细胞、树突状细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肥大细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、浆细胞和T细胞。细胞组成在不同条件下发生明显变化：T细胞比例从HC的36.5%降至PD的23.9%，中性粒细胞从8.0%升至15.8%，内皮细胞从0.7%升至14.1%；PDT中浆细胞占44.7%。
3.2 细胞类型分辨的铁死亡分析突出SAT1在PD与HC比较中的意义
样本水平铁死亡基因集平均评分在HC为0.081、PD为0.114、PDT为0.076。细胞类型平均评分显示PD树突状细胞最高（0.292）。在细胞类型伪批量分析中，SAT1是唯一达到FDR显著性水平的基因（log2FC = 0.546；FDR = 0.012），提示其在牙周炎中具有潜在的跨细胞类型表达上调。
3.3 内皮细胞轨迹与条件相关配体-受体共表达
2,570个内皮细胞沿扩散伪时间轨迹排列，中位伪时间值从HC的0.377增至PD的0.511和PDT的0.715。铁死亡评分与伪时间呈弱正相关（Spearman ρ = 0.129，p < 0.001）。配体-受体共表达分析显示CXCL8-CXCR1、CXCL12-CXCR4和IL1B-IL1R1为PD中最强的信号对。
3.4 发现队列定义铁死亡相关OSCC程序
GSE30784中发现10,757个FDR < 0.05的差异表达基因（6,131个上调，4,626个下调）。KEGG铁死亡通路中27个基因达到显著性，其中SLC39A14显著上调（log2FC = 2.469），TF显著下调（log2FC = ?3.595）。基于显著铁死亡基因方向构建的特征评分在对照组中位数为?0.725，OSCC中为0.211（p < 0.001）。
3.5 铁死亡特征在独立口腔舌鳞癌队列中复制
GSE13601验证队列中，基因组水平效应与GSE30784呈显著正相关（Spearman rho = 0.436，p < 0.001）。固定方向的铁死亡特征评分在肿瘤中位数为0.322、正常组织为?0.334（p < 0.001），外部ROC分析的AUC达0.933。
3.6 PD与微生物代谢功能的协调性丧失相关
GSE54290中晚期PD与健康对照比较发现25个FDR < 0.05的差异功能注释，其中磷酸葡萄糖酸脱水酶（log2FC = ?2.650）、亚铁螯合酶（log2FC = ?1.705）和转醛醇酶（log2FC = ?1.246）为最强降低项。铁/血红素类别信号从7.117降至5.412，谷胱甘肽/硫信号从6.360降至5.154。
3.7 跨研究OSCC微生物组保留项目稳健的疾病信号
整合的OSCC微生物组资源中，OSCC的Shannon多样性高于HC（中位数4.359 vs. 4.185，p < 0.001）。项目校正后293个特征达到FDR < 0.05，其中OTU 886264（Rothia mucilaginosa）为最强耗竭特征（校正CLR差异?0.835）。项目留出分类的AUC为0.674。
3.8 三队列转录组排序突出SAT1在PD和OSCC中的一致性
SAT1在PD单细胞摘要、GSE30784和GSE13601三个队列中均为正向效应（效应值分别为0.546、0.766和1.203），获得最高证据评分4.0。两个OSCC队列在铁死亡基因水平高度一致（rho = 0.709），而PD伪批量效应与GSE30784的对应关系较弱（rho = 0.129，p = 0.426）。
3.9 牙周细胞中铁死亡相关基因的RT-qPCR验证
LPS刺激后，HGFs中GPX4（2.47倍）、SLC7A11（2.89倍）和FTH1（2.21倍）显著上调，ACSL4下调（0.52倍）；巨噬细胞变化更显著：GPX4（3.15倍）、SLC7A11（3.67倍）、FTH1（2.78倍）和ACSL4（0.41倍）。两种细胞类型的变化高度相关（r = 0.94）。
3.10 铁死亡相关蛋白表达的ELISA验证
蛋白水平变化与mRNA一致：HGFs中GPX4（2.18倍）、SLC7A11（2.45倍）、FTH1（2.08倍）升高，ACSL4（0.56倍）降低；巨噬细胞中GPX4（2.74倍）、SLC7A11（3.11倍）、FTH1（2.55倍）升高，ACSL4（0.46倍）降低。mRNA-蛋白相关性在HGFs为r = 0.96、巨噬细胞为r = 0.98。
四、讨论与结论
讨论部分指出，该研究的主要贡献在于对铁死亡相关转录模式和口腔微生物变化的跨队列描述。由于这些检测并非来自匹配患者，结果应被视为汇聚但独立的证据线索，而非已证实的微生物-铁死亡-免疫因果轴或PD向癌症进展的轨迹。样本水平的KEGG铁死亡基因集评分是描述性组均值，同一评分中包含促铁死亡和抑铁死亡基因，不能解释为细胞死亡的定量测量。SAT1作为跨三个转录组队列的候选共享关联基因值得关注，但PD与OSCC之间广泛的分子等效性尚未确立。微生物分析中，牙周HuMiChip阵列强度描述微生物功能基因代表性，OSCC 16S数据主要反映分类学丰度而非直接功能测量，两者均不能证明宿主-微生物相互作用。
研究结论为：在独立采样的牙周和口腔癌数据集中，观察到铁死亡相关基因表达、牙龈细胞组成和口腔微生物谱的疾病相关变异。SAT1在PD细胞类型伪批量分析中呈正向关联，并在两个OSCC转录组队列中显示一致的正向效应；源自发现队列的表达特征在一个外部队列中区分了肿瘤与正常组织。微生物数据代表并行的、非患者匹配的证据，LPS实验测量了选定的RNA和蛋白标志物而非铁死亡性细胞死亡。这些关联产生假设，但不能确立牙周炎到OSCC的因果轨迹、经过验证的诊断或风险预测生物标志物、功能性铁死亡机制或治疗有效性。
