红薯藤来源果胶多糖IBPS-3A的结构表征及其通过TLR2/4-NF-κB/MAPK通路诱导巨噬细胞M1极化的免疫调节活性

《Food Science & Nutrition》：Structural Characterization and Immunomodulatory Activity of a Polysaccharide From Ipomoea batatas L. Vine: Activation of Macrophage

　　

红薯藤在东亚地区长期被食用，尽管营养丰富，但常未得到充分利用。本研究从红薯藤中分离纯化得到一种名为IBPS-3A的果胶。通过FT-IR、单糖组成分析、甲基化分析以及一维/二维NMR波谱（COSY、HSQC、TOCSY、HMBC和NOESY）的综合结构表征，鉴定IBPS-3A为一种酸性杂多糖，分子量约为56 kDa，主链主要含有→4)-α-D-GalpA-(1→和→2,4)-α-L-Rhap-(1→连接，并带有阿拉伯半乳聚糖侧链。进一步研究发现，IBPS-3A可剂量依赖性诱导RAW264.7巨噬细胞M1极化，刺激TNF-α、IL-6和NO的分泌，进而抑制共培养B16黑色素瘤细胞的活力。机制上，Toll样受体（TLR）4和TLR2是介导IBPS-3A免疫刺激作用的潜在受体，随后激活NF-κB和MAPK（p38）信号级联。综上，这些发现表明IBPS-3A是红薯藤中的一种生物活性多糖，并凸显了其在免疫调节应用中的潜力。

研究背景：红薯（Ipomoea batatas L.）为旋花科高产适应性粮食作物，富含碳水化合物、蛋白质、叶酸、维生素和黄酮类化合物，其茎叶同样营养丰富并含有多种生物活性成分。红薯藤在东亚有长期食用历史，传统中医理论认为其具有祛风通络、活血散瘀、消肿止痛等药理作用。已有研究从红薯藤中分离出黄酮和维生素等小分子化合物并证实其免疫调节和抗氧化功能，但相较于红薯块根，红薯藤活性成分研究仍不充分，尤其缺乏对果胶多糖等结构复杂生物大分子的系统研究。果胶多糖是广泛分布于植物初生细胞壁和胞间层的酸性杂多糖，其结构因植物来源、生长环境和提取方法而异，主要包括同型半乳糖醛酸聚糖（HG）、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I（RG-I）、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-II（RG-II）和木糖半乳糖醛酸聚糖（XGA）四个基本结构域。果胶多糖具有抗氧化、降血糖、免疫调节、抗肿瘤、抗炎和抗病毒等多种药理活性，其精细结构特征与免疫调节活性密切相关。然而，红薯藤来源果胶多糖的结构表征尚未系统开展，其结构特征与免疫调节活性之间的构效关系仍不清楚。免疫治疗是肿瘤治疗的新兴途径，巨噬细胞靶向策略主要聚焦于促进M1样极化及将M2样重编程为M1样表型，多种果胶多糖已被报道可促进M1极化，但红薯藤果胶多糖是否通过巨噬细胞极化发挥免疫调节作用尚不明确。因此，研究人员开展本研究，从红薯藤中分离纯化多糖IBPS-3A，系统表征其结构特征，并研究其免疫调节作用特别是诱导RAW264.7巨噬细胞M1极化的能力。研究得出，该果胶多糖主要通过TLR4和TLR2受体促进巨噬细胞M1极化，随后触发下游NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联反应，为将红薯藤多糖用作免疫调节功能食品奠定了基础。

关键技术方法：研究人员以南京农业大学提供的红薯藤（去叶后60°C干燥）为原料，经热水提取、乙醇沉淀、Sevag法脱蛋白获得粗多糖IBPS，依次经DEAE-52阴离子交换柱层析和Superdex G-200凝胶柱层析纯化得到IBPS-3A。采用苯酚-硫酸法测定总糖、考马斯亮蓝法测定蛋白、HPGPC测定分子量及分布、HPLC分析单糖组成、FT-IR和SEM分析光谱与表面形态、甲基化结合GC-MS分析糖苷键类型、一维/二维NMR（1H-NMR、13C-NMR、DEPT-135、COSY、HSQC、TOCSY、HMBC、NOESY）解析糖残基连接方式。细胞实验采用RAW264.7巨噬细胞和B16黑色素瘤细胞，通过CCK-8法检测细胞活力、ELISA测定TNF-α和IL-6、硝酸盐还原法测定NO、Western blot检测iNOS、Arg-1、p-p65/p65及p-p38/p38蛋白表达、免疫荧光染色观察iNOS、条件培养基实验和Transwell共培养体系评估对B16细胞的细胞毒作用、TLR2抑制剂C29和TLR4抑制剂TAK-242阻断实验以及AutoDock Vina分子对接分析IBPS-3A与TLR2/4的相互作用。

研究结果：
3.1 红薯藤多糖的分离纯化：从100 g红薯藤中获得1.26 g粗多糖IBPS，经DEAE-52柱层析得到中性组分IBPS-1和酸性组分IBPS-2、IBPS-3，初步实验显示IBPS-3在12.5 μg/mL低浓度下显著促进RAW264.7细胞极化，故进一步经Superdex G-200纯化得到单一主峰IBPS-3A，从100 g干燥红薯藤中获得280 mg纯化品，提取率为0.28%。化学分析显示IBPS-3A总糖含量为96.23%±1.3%，未检出蛋白污染，内毒素含量为0.000125–0.00025 EU/μg。HPGPC分析显示IBPS-3A呈尖锐对称峰，重均分子量为56,077 Da（Mn=29,711 Da，Mz=87,923 Da，PDI=1.88）。UV-Vis光谱在200–400 nm显示多糖特征吸收，未见蛋白或核酸吸收峰。
3.2 FT-IR和单糖组成分析：FT-IR显示3428.77 cm?1处O-H伸缩振动宽峰、1612.66 cm?1处糖醛酸游离羧酸根（COO-）不对称伸缩振动（提示为酸性多糖）、1100.38 cm?1和1016.71 cm?1处C-O键弯曲振动（提示吡喃糖环）以及893.86 cm?1处β-吡喃糖苷键特征吸收。单糖组成分析表明IBPS-3A为酸性杂多糖，主要由半乳糖醛酸（GalA）、半乳糖（Gal）、阿拉伯糖（Ara）、鼠李糖（Rha）及微量葡萄糖（Glc）组成，GalA和Gal合计约占总摩尔百分比的80%，具有典型果胶多糖特征。SEM显示样品呈均匀分布的片状结构，表面光滑、排列紧密。
3.3 甲基化分析：经糖醛酸还原后甲基化并结合GC-MS分析，鉴定出10种部分甲基化阿尔迪醇乙酸酯（PMAAs），分别为t-Araf、1,5-Araf、t-Galp、t-GalpA、1,2,4-Rhap、1,4-Galp、1,4-GalpA、1,4-Glcp、1,4-GlcpA和1,3-Galp。其中1,4-GalpA占总量的70%以上，提示主链以HG结构域为主；1,2,4-Rhap的存在提示RG-I结构域；1,5-Araf、1,3-Galp和1,4-Galp提示存在阿拉伯半乳聚糖侧链。
3.4 NMR波谱分析：通过一维（1H-NMR、13C-NMR、DEPT-135）和二维（COSY、HSQC、TOCSY、HMBC、NOESY）NMR结合单糖组成和甲基化结果，对糖残基进行归属，主要残基类型依次标记为GA1,4、Rα、Rβ、GAt、G1,4、Gt、At、A1,5、ΔGA和Rha1,2,4。HMBC和NOESY远程相关分析确定了以下连接方式：→4)-α-D-GalpA-(1→4)-α-D-GalpA-(1→、→4)-α-D-GalpA-(1→2,4)-α-L-Rhap-(1→（O-2位连接）、→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→、β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→、→5)-α-L-Araf-(1→5)-α-L-Araf-(1→、α-L-Araf-(1→5)-α-L-Araf-(1→、→5)-α-L-Araf-(1→2,4)-α-L-Rhap-(1→（O-4位连接）和→4)-β-D-Galp-(1→2,4)-α-L-Rhap-(1→（O-4位连接）。综合推断IBPS-3A为复杂杂多糖，主要由广泛的HG结构域和部分分支的RG-I结构域组成，形成果胶多糖。
3.5 IBPS-3A诱导RAW264.7细胞M1极化：IBPS-3A处理后RAW264.7细胞呈纺锤形并伸出细长伪足的M1极化形态特征，CCK-8实验证实IBPS-3A浓度依赖性显著增强细胞增殖。M1相关标志物iNOS表达增加而M2相关标志物Arg-1降低，ELISA检测显示TNF-α、IL-6和NO分泌呈浓度依赖性增加，在所测浓度范围内IBPS-3A的促进作用比LPS更明显，免疫荧光染色直观证实细胞内iNOS水平升高。
3.6 IBPS-3A处理RAW264.7细胞条件培养基对B16细胞的细胞毒作用：IBPS-3A（6.25–200 μg/mL）对B16细胞无直接细胞毒作用。条件培养基（CM）浓度为1.25%和2.5%时各处理组无细胞毒作用；CM浓度5%时最高剂量IBPS-3A使B16细胞活力降低13.7%，10%时降低16.5%；CM浓度增至20%及以上时，LPS或IBPS-3A处理的RAW264.7细胞CM显著降低B16细胞活力约30%，最高剂量IBPS-3A在50% CM比例下使B16细胞活力降低35%，接近饱和；PI染色直观显示IBPS-3A条件培养基处理后活细胞密度明显降低、死细胞增多。
3.7 共培养体系中IBPS-3A对B16细胞的细胞毒作用：建立Transwell共培养体系，低B16细胞密度（5×10?/孔）下IBPS-3A使RAW264.7介导的细胞毒作用从10.2%增至最高20.1%；较高B16密度（1.5×10?/孔）下B16活力降低从11.2%增至最高29.5%；RAW264.7密度增至8×10?/孔并用50 μg/mL IBPS-3A处理时细胞毒作用较未处理对照增强25.8%。活/死染色显示IBPS-3A显著降低活细胞密度并增加死细胞数，50 μg/mL时活细胞密度降至无共培养对照组的一半以下，与CCK-8结果一致。表明IBPS-3A诱导的RAW264.7 M1极化可在共培养体系中有效降低B16细胞活力。
3.8 IBPS-3A通过TLR2和TLR4激活RAW264.7细胞M1极化：C29（<50 μmol/L）和TAK-242（<10 μmol/L）不影响RAW264.7细胞活力；C29对LPS刺激的TNF-α分泌有一定抑制，提示TLR2在LPS信号识别中起辅助作用，而TAK-242显著消除LPS刺激的TNF-α升高，提示TLR4在LPS诱导M1极化中起重要作用。两种抑制剂均显著抑制IBPS-3A诱导的NO分泌增加；C29轻微降低而TAK-242更明显抑制IBPS-3A刺激的TNF-α和IL-6分泌；两抑制剂联合处理时三种炎症因子水平均低于空白对照，提示TLR2和TLR4是介导IBPS-3A诱导M1极化的潜在受体。分子对接预测IBPS-3A与TLR2/4具有潜在结合作用，且侧链结合能（TLR2-侧链R1：?5.02 kcal/mol；TLR4-侧链R1：?5.09 kcal/mol；TLR4-侧链R2：?5.48 kcal/mol）明显高于主链（TLR2-主链：?3.27 kcal/mol；TLR4-主链：?4.22 kcal/mol）。Western blot显示IBPS-3A处理后p-p65/p65和p-p38/p38比值升高，联合抑制剂处理后降低，表明TLR2/4-MyD88/TRIF-NF-κB和TLR2/4-MyD88/TRIF-MAPK信号通路参与IBPS-3A诱导的巨噬细胞M1极化。综上，IBPS-3A可能通过TLR2和TLR4发挥免疫刺激作用，随后触发NF-κB和MAPK信号通路诱导巨噬细胞M1极化。

讨论部分总结：果胶多糖作为植物细胞壁重要组分具有多种生物活性 particularly免疫调节潜力，但不同植物来源果胶因精细结构差异而表现出不同活性和机制。本研究首次从红薯藤中提取纯化并系统表征了果胶多糖IBPS-3A，并探讨了其通过诱导巨噬细胞M1极化发挥免疫调节作用的机制。IBPS-3A分子量约56 kDa，主链主要由2-α-L-鼠李糖和4-α-D-半乳糖醛酸组成，鼠李糖残基O-4位被阿拉伯聚糖和半乳聚糖取代。M1/M2巨噬细胞极化平衡在先天免疫监视中起关键作用，IBPS-3A剂量依赖性诱导RAW264.7巨噬细胞M1极化，表现为活化状态形态变化、浓度依赖性细胞增殖增加、促炎细胞因子TNF-α和IL-6分泌及关键效应分子NO产生显著增加，同时上调M1标志蛋白iNOS并下调M2标志蛋白Arg-1，与其他膳食果胶（如党参和枳壳果胶）的免疫刺激作用一致。IBPS-3A本身对B16黑色素瘤细胞无直接细胞毒作用，但其预处理巨噬细胞的条件培养基有效抑制B16细胞增殖，提示抗增殖作用通过免疫系统激活间接介导而非直接细胞毒作用；Transwell共培养体系进一步证实IBPS-3A活化巨噬细胞以剂量和细胞密度依赖方式显著诱导B16细胞死亡，表明IBPS-3A可激发巨噬细胞重要效应功能，凸显其作为免疫调节剂的潜力。TLRs是肠道相关淋巴组织（GALT）中膳食多糖的关键识别受体，分子对接预测IBPS-3A与TLR2/4具有潜在结合作用，抑制剂实验显示TLR4特异性抑制剂强烈抑制IBPS-3A诱导的炎症因子产生而TLR2抑制剂呈部分抑制作用，两者联用抑制效果最大，提示TLR4可能是IBPS-3A的主要功能受体而TLR2可能发挥协同或辅助识别作用；Western blot证实IBPS-3A显著增加p65（NF-κB通路）和p38（MAPK通路）磷酸化水平且被TLR2/4抑制剂阻断，表明IBPS-3A可能结合巨噬细胞表面TLR4（及TLR2），启动下游MyD88/TRIF依赖性信号，激活NF-κB和p38 MAPK通路，最终驱动M1极化。此外，RG-I区域复杂中性糖侧链特别是富含(1→5)-α-L-Araf连接的高度分支阿拉伯半乳聚糖可能作为高效激活TLR2/4信号的关键“信号标签”，鉴于IBPS-3A在RG-I区域具有类似阿拉伯半乳聚糖侧链，可合理推测其遵循类似的免疫识别机制，本研究为进一步探索红薯藤果胶多糖免疫调节机制及相关信号通路奠定了基础。

研究结论翻译：本研究成功从红薯藤中分离纯化得到多糖IBPS-3A。IBPS-3A分子量约为56 kDa，为酸性杂多糖，主链主要由2-α-L-鼠李糖和4-α-D-半乳糖醛酸组成，鼠李糖残基O-4位被阿拉伯聚糖和半乳聚糖取代。研究人员首次报道该多糖具有强效免疫调节活性，具体通过TLR2/4介导的NF-κB/p38 MAPK激活诱导巨噬细胞向M1表型极化，该激活导致显著的巨噬细胞依赖性肿瘤细胞增殖抑制，证实了IBPS-3A作为免疫刺激剂的功能效力。本研究凸显了红薯藤多糖作为免疫调节功能食品的应用潜力。