《JOURNAL OF FOOD SCIENCE》：Microbial Characteristics of Weissella cibaria HRL3 and Its Immunostimulatory Effects via TLR3/TLR9-Dependent IFN-α Production
编辑推荐：
Rhinacanthus nasutus（L.）Kurz是一种药用植物，其根、茎和叶常用于茶饮和传统中药；然而，其花的有益作用仍有待研究。本研究使用含果糖（该花中含量丰富）的培养基，分离了R. nasutus（L.）Kurz花中的乳酸菌（LAB），并随后分析了
Rhinacanthus nasutus（L.）Kurz是一种药用植物，其根、茎和叶常用于茶饮和传统中药；然而，其花的有益作用仍有待研究。本研究使用含果糖（该花中含量丰富）的培养基，分离了R. nasutus（L.）Kurz花中的乳酸菌（LAB），并随后分析了其微生物学特征。基于全基因组测序，分离的LAB菌株被鉴定为Weissella cibaria，并命名为HRL3。该菌株为兼性厌氧菌，在好氧条件下生长受到促进，并被归类为通过乳酸发酵产生乳酸和乙醇的异型发酵LAB。此外，HRL3菌株表现出与W. cibaria模式菌株不同的独特碳水化合物利用谱。本研究还考察了HRL3菌株的免疫刺激作用。当加入小鼠脾细胞时，HRL3菌株诱导了IFN-α的产生，IFN-α是一种在增强抗病毒免疫应答中发挥关键作用的细胞因子。这种诱导可能通过内体Toll样受体（TLR）3和TLR9的识别而发生。Dectin-1也可能有助于HRL3菌株诱导的IFN-α产生。在甲型流感病毒（IAV）感染的小鼠模型中，口服给予HRL3菌株与IFN-α mRNA表达增加、IAV M mRNA表达降低以及肺部组织病理学改变减轻相关。这些发现为R. nasutus（L.）Kurz花的功能潜力和HRL3菌株的免疫调节活性提供了新的见解。
研究背景方面，乳酸菌（LAB）可通过同型乳酸发酵或异型乳酸发酵代谢碳水化合物产生乳酸，同型发酵几乎只生成乳酸，而异型发酵除乳酸外还产生乙醇和乙酸；乳酸发酵通路的激活对LAB生长至关重要，多数LAB在厌氧条件下生长，但部分菌种在好氧条件下生长更好，培养环境因素可影响LAB增殖。天然免疫系统是宿主快速识别并清除病毒、细菌等非己分子的防御机制，干扰素（IFN）-α是抗病毒免疫应答的核心细胞因子，通过诱导IFN刺激基因（ISGs）表达抑制病毒复制，并通过促进树突状细胞和自然杀伤细胞活化增强天然免疫；IFN-α主要由表达Toll样受体（TLRs）的树突状细胞和巨噬细胞产生，细胞表面TLRs包括TLR2和TLR4，内体TLRs包括TLR3、TLR7和TLR9，各自识别不同的病原相关分子模式，其中TLR3、TLR4、TLR7和TLR9信号可激活IFN调节因子（IRFs）产生I型IFN；内体TLR配体需经C型凝集素受体（CLR）信号等摄取途径内化，部分CLR依赖Ca2+结合碳水化合物，部分通过脾酪氨酸激酶（Syk）招募活化。R. nasutus（L.）Kurz作为茶饮和传统中药使用，具有抗炎和抗病毒作用，其活性成分白花蛇舌草素类化合物在根、茎、叶中丰富而在花中几乎缺失，花中主要含果糖、葡萄糖和蔗糖。因此，本研究旨在探究R. nasutus（L.）Kurz花的新功能特性，假设以果糖为碳源可分离出该花特有的LAB菌株，并对HRL3菌株的功能特性进行分析。
研究人员从R. nasutus（L.）Kurz中分离出W. cibaria HRL3，通过分析生长、碳水化合物利用和终代谢产物评估其微生物学特征，并研究其免疫刺激作用特别是IFN-α诱导能力。结论为：HRL3菌株经TLR3和TLR9介导的核酸识别诱导IFN-α产生，口服给予HRL3可减轻甲型流感病毒诱导的小鼠肺损伤，与IFN-α在抗病毒免疫中的关键作用一致；这些发现凸显了R. nasutus（L.）Kurz花此前未被认识的价值，HRL3菌株是增强抗病毒免疫的有前景的功能性食品原料。
关键技术方法方面（不超过250字）：研究人员采用含果糖的果糖酵母胨（FYP）肉汤好氧培养结合碳酸钙平板透明圈法从花中分离LAB；通过全基因组测序（WGS）结合16S rRNA基因序列分析、基于BLAST的平均核苷酸一致性（ANIb）和数字化DNA-DNA杂交（dDDH）进行菌种鉴定，并筛查耐药基因和毒力相关基因；按欧洲食品安全局（EFSA）指南以肉汤微量稀释法测定最小抑菌浓度（MIC），并进行溶血试验；采用API 50 CH分析碳水化合物发酵谱，用酶法测定乳酸、乙醇和乙酸产量；以热灭活HRL3刺激小鼠脾细胞和RAW264细胞，结合ELISA、抑制剂处理、核酸酶处理、RNA/DNA转染和流式细胞术解析受体与摄取机制；采用甲型流感病毒A/Puerto Rico/8/34（H1N1；PR8）感染C57BL/6小鼠模型，经口给予HRL3后行组织学分析和逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）。所用菌株来源于日本Arsoa R&D Center，模式菌株和细胞系来源于日本相关菌种保藏机构。
研究结果方面：3.1 分离、鉴定与代谢特征——HRL3基因组大小为2,430,012 bp，GC含量44.84%，含49个contig、2293个编码序列、10个rRNA基因、73个tRNA基因和3个ncRNA基因；ANIb和dDDH分析显示其与W. cibaria亲缘最高（ANIb 98.34%，dDDH 85.2%），与其他Weissella种均低于种界定阈值；未检出耐药基因，毒力基因筛查仅发现与Francisella tularensis tRNA基因FTTt19同源的序列（89.19%一致性、100%覆盖度），且该序列亦存在于包括安全性明确的W. cibaria CMU在内的公开基因组中；药敏试验中仅卡那霉素（MIC 128 mg/L）超过EFSA折点被判为耐药，其余均敏感；溶血试验中HRL3呈现类似α-溶血对照的菌落形态，但全基因组分析未发现溶血素相关基因，提示该晕环可能源于过氧化氢产生等代谢活动的颜色变化；生长曲线显示好氧条件下最大光密度（0.228）高于厌氧条件（0.156）；API 50 CH显示49种底物中利用17种，与BacDive中W. cibaria参考菌株差异显著，提示其对特定生境的适应；代谢产物测定显示乳酸与乙醇摩尔浓度相当、乙酸少量，表明其为异型发酵LAB。3.2 负责HRL3诱导IFN-α产生的受体鉴定——HRL3以浓度依赖方式诱导脾细胞产生IFN-α（100 μg/mL时26.9 ± 8.0 pg/mL）；TLR2?/?和TLR4?/?小鼠脾细胞与野生型无显著差异；氯喹（CQ）处理使IFN-α由23.6 ± 5.3 pg/mL降至6.3 ± 3.0 pg/mL，提示内体TLR参与；TLR3抑制剂和TLR9抑制剂分别使IFN-α由52.5 ± 7.4 pg/mL降至3.5 ± 2.0 pg/mL和21.3 ± 5.8 pg/mL，TLR7抑制剂无显著影响，表明经内体TLR3和TLR9诱导。3.3 HRL3核酸诱导的IFN-α产生——RNase A和DNase I处理分别使IFN-α由15.1 ± 2.1 pg/mL降至3.0 ± 2.2 pg/mL和2.0 ± 0.8 pg/mL；转染HRL3来源RNA和DNA分别使IFN-α升至12.9 ± 3.8 pg/mL和65.9 ± 27.5 pg/mL（对照1.8 ± 2.0 pg/mL），表明其RNA和DNA作为内体TLR3和TLR9的免疫刺激配体。3.4 HRL3诱导IFN-α产生对吞噬作用的需求——细胞松弛素D（CyD）在0.25和0.50 μM均显著降低IFN-α（由19.5 ± 2.9 pg/mL降至9.4 ± 1.2 pg/mL和8.4 ± 4.1 pg/mL），并使FITC+细胞比例由41.5 ± 6.0%降至23.6 ± 8.7%，表明吞噬作用为必需。3.5 诱导HRL3摄取的受体鉴定——Syk抑制剂R406使IFN-α由31.2 ± 4.6 pg/mL降至6.3 ± 3.3 pg/mL，EDTA无显著影响；抗Dectin-1中和抗体使IFN-α由37.8 ± 6.1 pg/mL降至12.3 ± 4.8 pg/mL；苯胺蓝染色显示HRL3无可检测的β-1,3-葡聚糖，提示可能存在其他被Dectin-1识别的结构，Dectin-1和Syk信号可能作用于TLR识别上游。3.6 口服HRL3诱导的抗病毒免疫应答——在PR8感染小鼠模型中，PR8 + HRL3组感染后1天肺部IFN-α mRNA表达由1.0 ± 0.04倍升至1.7 ± 0.2倍，感染后3天IAV M mRNA表达由1.0 ± 0.1倍降至0.7 ± 0.1倍，组织学显示PR8组明显淋巴细胞聚集和细支气管周围炎性细胞浸润，而PR8 + HRL3组这些病理改变减轻，提示口服HRL3与早期IFN-α表达增加、病毒复制减少和肺部炎症减轻相关，可能经肠-肺轴介导。
讨论与结论部分总结：既往研究提示口服热灭活LAB可增强肠道和肺部免疫应答，肠-肺轴可能在增强抗病毒免疫中发挥作用；本研究中口服热灭活HRL3亦增加肺部IFN-α表达，I型干扰素经干扰素-α/β受体信号诱导ISGs表达，感染后1天IFN-α升高继以3天IAV M基因表达降低，提示早期肺部IFN-α应答可能经肠-肺轴抑制IAV复制；病毒感染炎症肺组织中诱导性支气管相关淋巴组织（iBALT）由B细胞和T细胞在细支气管周围聚集形成，流感病毒感染可经炎性细胞浸润引起细支气管周围炎症，PR8 + HRL3组iBALT样结构形成减少可能归因于病毒复制抑制和局部肺部炎症减轻所致的抗原刺激减少。结论译文：本研究聚焦于R. nasutus（L.）Kurz的花，该药用植物的功能特性日益受到关注而其生物学功能此前基本未被探索。从R. nasutus（L.）Kurz花中分离的LAB菌株HRL3，通过将基于全基因组测序的菌种鉴定与基因组分析（包括耐药基因和毒力相关基因评估）以及表型安全性评价相结合而被全面表征。HRL3菌株经TLR3和TLR9介导的对其核酸的识别诱导IFN-α产生。此外，口服给予HRL3菌株减轻了甲型流感病毒诱导的小鼠肺损伤，这与IFN-α在抗病毒免疫中的关键作用一致。这些发现凸显了R. nasutus（L.）Kurz花此前未被认识的价值。此外，HRL3菌株是增强抗病毒免疫的有前景的功能性食品原料。
