功能性饮料在常温储藏条件下的货架期初探：甘蔗（Saccharum officinarum）、辣木（Moringa stenopetala）与大麦麦芽配方的抗氧化保持与微生物稳定性研究

《JOURNAL OF FOOD PROCESSING AND PRESERVATION》：A Preliminary Study on Shelf Life of Functional Beverage Developed From Sugarcane (Saccharum officinarum), Moringa stenopetala, and Barley Malt Stored Under Ambient Conditions

　　

本研究为前期已发表配方表征工作的延伸，旨在评估常温储藏条件下配方的抗氧化保持能力与微生物稳定性。鉴于分析范围有限且每种配方仅设两个重复，本研究的目的是指示常温储藏条件下功能性饮料的货架期。常温储藏会加速降解并缩短货架期。研究采用无菌加工、气密玻璃瓶灌装、灌装后巴氏杀菌，以及主要源自辣木（Moringa stenopetala）叶提取物的植物化学物作为防腐剂，以提供抗氧化与抗菌能力来延长饮料货架期。总酚与总黄酮采用分光光度法定量，铁还原抗氧化能力（FRAP）与2,2-二苯基-1-苦基肼基（DPPH）自由基清除活性亦采用分光光度法测定。微生物活菌落形成单位（CFU）通过膜过滤法使用监测器计数。在饮料中加入20%–30%的M. stenopetala叶提取物可改善抗氧化保持与微生物稳定性，从而指示常温储藏条件下货架期可延长至8周。相比之下，M. stenopetala含量低于20%的配方货架期低于8周。在所开发产品中，CM8（70%甘蔗、20% M. stenopetala与10%麦芽）、CM9（70%甘蔗、25% M. stenopetala与5%麦芽）与CM10（70%甘蔗与30% M. stenopetala）在储藏8周后保持了较好的抗氧化能力并仍处于微生物安全限值之内。

功能性饮料是指通过添加抗氧化剂、维生素和矿物质等生物活性化合物，在基础营养之外提供健康益处的饮品。由辣木（Moringa stenopetala）叶、甘蔗（Saccharum officinarum）与大麦麦芽制备的饮料具有营养密集的特点和潜在治疗特性。M. stenopetala提供多种维生素、矿物质以及一系列具有抗炎、抗菌和抗氧化活性的酚类与黄酮类化合物。这些植物化学物加入饮料后，与改善代谢健康、降低氧化应激和支持免疫功能相关联。甘蔗提供天然糖分和矿物质，可在不使用合成添加剂的情况下平衡风味，而大麦麦芽提供酶类、B族维生素和可发酵糖，增强消化性和感官特性。尽管具有这些组成优势，常温（通常25°C–30°C）储藏会加速氧化降解、酶促反应和微生物增殖，从而缩短货架期并损害抗氧化能力与安全性。因此延长货架期需要结合卫生加工、气密包装、灌装后巴氏杀菌以及使用M. stenopetala叶提取物等抗菌和抗氧化剂。除无菌加工外，本研究采用主要源自M. stenopetala叶提取物的植物化学物作为天然防腐剂，赋予抗氧化和抗菌活性，从而增强饮料货架期。尽管该饮料的理化、营养和感官特性此前已有报道，但常温储藏条件下抗氧化化合物保持和微生物稳定性的数据仍需研究。因此，本前期研究的目的是评估常温储藏对总酚含量（TPC）、总黄酮含量（TFC）、DPPH自由基清除活性、铁还原抗氧化能力（FRAP）和微生物稳定性的影响，并据此估计饮料的实际货架期。

研究人员沿用了Zena等此前研究的实验设计、配方、样品制备和储藏方案，因为本工作并非全面研究，而是对M. stenopetala叶提取物作为天然防腐剂的可行性评价。采用JMP软件中的混料设计确定最佳饮料开发条件和配比，混料设计作为实现预期目标的主要工具。混料设计受到约束，使各成分（甘蔗、麦芽和M. stenopetala）之和等于总配方的100%。具体而言，甘蔗部分范围为70%至100%，麦芽与M. stenopetala合计部分范围为0%至30%，其中麦芽部分限制为0%–15%，M. stenopetala部分限制为0%–30%。使用JMP软件选出十种配方。每种配方制备两个独立重复（即两个分别制备的批次，涉及独立称量原料、发芽、糖化、成熟、巴氏杀菌和储藏）。对这两个独立重复的样品，所有预定测量如TPC、TFC、DPPH自由基清除活性、FRAP、总细菌（TB）计数、酵母/霉菌计数和大肠菌群计数均进行三次测定。样品制备方案沿用Zena等2025年的研究。饮料开发配方借鉴当前科学和饮料加工技术进行了调整，但最初取自埃塞俄比亚南部Wolaita人制备甘蔗饮料的传统方法。新鲜甘蔗采集自锡达马地区距Hawassa市约25 km的Wodogenet地区。甘蔗样品经清洗并剥去外层硬皮，用刀切碎，用Borosil Primus II研磨混合机研磨，并在置于炉上的宽不锈钢盘中于95°C烘烤10 min，直至甘蔗颜色变为金棕色。烘烤后的甘蔗必须冷却至室温，装入气密塑料袋，冷藏保存至饮料制备日。成熟M. stenopetala叶采集自Hawassa大学农学院院内。叶片用饮用水清洗后在室温阴凉处干燥3天，然后用NutriMill NM-10磨粗磨成粉，最后装入塑料袋，存放于干燥清洁的架子上至饮料制备日。大麦麦芽（Hordeum vulgare）取自Hawassa农业研究所。大麦先经清理、清洗，在塑料桶中浸泡24 h，然后在塑料桶中发芽3天。发芽大麦晒干3天，用NutriMill NM-10粗磨得到麦芽粉。粗磨麦芽粉在塑料盆中逐渐加入饮用水揉捏成团，揉好的麦芽面团静置过夜，并在置于炉上的热不锈钢盘中于55°C连续搅拌烘烤10 min，直至面团颜色变为棕色。烘烤后的麦芽面团冷却至室温，装入塑料袋，冷藏保存至饮料制备日。每种配方制备两个独立重复，按配比准备20个塑料桶（每种配方两个同标签桶）。原料与水的比例为1 kg原料对2 L饮用水，即每批5 kg总原料对10 L水。根据每种配方的配比计算所需甘蔗量并用分析天平准确称量，转入相应标记桶中。同样，M. stenopetala叶粉和烘烤大麦麦芽按指定比例称量加入。以此方式，每套重复制备20个混合物（每种配方两个）。然后向每个桶中加入10 L温水（60°C）以激活麦芽酶进行淀粉水解。混合物充分搅匀，冷却至室温，用盖子密封，在常温下储藏3天以进行酶解和饮料成熟。成熟后让饮料沉降，经700目筛过滤，灌装入玻璃瓶。瓶装饮料在80°C水浴中巴氏杀菌5 min，随后冷却至室温。冷却后的饮料存放于食品科学与技术实验室架子上常温储藏，用于理化、营养、抗氧化、感官和货架期研究。在12周常温储藏期间监测温度和相对湿度，平均温度为28.4^°C ± 1.2^°C，平均相对湿度为48% ± 3% RH。采用干燥提取物浓缩酚类和黄酮类，消除可变水分含量和基质干扰。结果以标准化干重基础表示，以保证分析准确性并允许不同配方和储藏期之间公平比较。饮料样品和所得干提取物的体积与质量按消费状态计算。制备饮料样品干提取物的方法为：取10 mL饮料样品于蒸发皿中称重，然后在40°C烘箱中放置24 h至完全干燥；干燥样品称重后用蒸馏水溶解，配成10 mg/mL溶液。TPC采用Kupina描述的Folin–Ciocalteu法测定，以没食子酸为标准。从10 mg/mL饮料提取物中吸取0.1 mL于试管中，加入1 mL Folin–Ciocalteu试剂，暗处放置5 min，然后加入1 mL碳酸钠，暗处放置90 min。所得蓝色溶液吸光度在765 nm处用紫外-可见分光光度计（JENWAY-6300，英国）测定。TPC由没食子酸校准曲线y = 0.0069x ? 0.0673，R² = 0.997估算，结果以每克提取物中没食子酸当量毫克数（mg GAE/g）表示。TFC采用Singh描述的氯化铝法测定。从10 mg/mL提取物中取1 mL用1.25 mL蒸馏水稀释，加入75 μL 5% NaNO₂；6 min后加入150 μL 10% AlCl₃，再5 min后加入1 mL 1 M NaOH，混合物变为粉红色。吸光度在510 nm处用紫外-可见分光光度计（JENWAY-6300，英国）测定。以儿茶素绘制标准线性校准曲线（y = 0.0014x + 0.0192，R² = 0.978），结果以每克干提取物中儿茶素当量毫克数（mgCE/g）表示。饮料提取物的铁还原活性采用BHT作为标准测定。取1 mL干燥饮料提取物与2.5 mL磷酸缓冲液（0.2 M，pH 6.6）和2 mL 1%（w/v）铁氰化钾混合，50°C孵育20 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸终止反应。取2.5 mL上清液与2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%氯化铁溶液混合，立即在700 nm处用紫外-可见分光光度计（JENWAY-6300，英国）测定吸光度，结果以每克干提取物中丁基羟基甲苯当量毫克数（mgBHTE/g）表示，计算采用线性方程y = 0.0097x + 0.125，R² = 0.995。DPPH自由基清除活性采用Benzie描述的方法测定。取10 mg/mL浓度样品1 mL于试管中，加入2 mL DPPH甲醇溶液（60 μM），充分摇匀，室温暗处孵育20 min，在520 nm处用紫外-可见分光光度计（JENWAY-6300，英国）记录吸光度。以2 mL DPPH溶液吸光度作为空白对照。样品对DPPH自由基的抑制百分比按公式计算，其中A₀为对照样品吸光度，A₁为测试样品吸光度。微生物活菌落形成单位（CFU）采用基于膜过滤技术的监测器定量。总细菌测定使用胰蛋白胨葡萄糖提取物肉汤培养基，酵母和霉菌测定使用M-Green培养基，大肠菌群使用M-Endo肉汤培养基，培养基按制造商程序制备。将BioSart 100监测器（无菌，100 mL，47 mm，0.45 μm）置于真空瓶塞孔上并连接真空泵。取下监测器盖，倒置于用70%酒精预清洁的工作台上。将100 mL饮料样品倒入监测器，打开真空直至样品通过滤膜，关闭真空。倾斜监测器释放残余真空后复位，向监测器加入约2 mL无菌微生物培养基并过滤数分钟。从真空泵上取下监测器，掰下并弃去中间部分，盖上监测器盖，将塞子插入底部开口，倒置孵育。总细菌在Binder Model BD 400（美国）培养箱中35°C孵育48 h；酵母/霉菌在MJX-70B酵母/霉菌培养箱中25°C孵育120 h；大肠菌群在Binder培养箱中35°C孵育24 h。使用Stuart SC6+计数菌落。结果进行统计评价，并与埃塞俄比亚公共卫生研究所标准比较。所有测量对两个独立生物学重复的样品进行三次测定。报告的均值和标准差代表两个独立重复之间的批间变异，计算时先对每批的三次技术测量取平均。数据采用全因子设计的双因素方差分析，均值分离和统计显著性判定采用JMP Pro 13软件中的最小二乘均值（LSMeans）Student′s t-检验，p < 0.05。

研究结果显示，储藏对植物化学物和抗氧化活性具有显著影响。研究人员每4周评估一次所开发饮料的植物化学物含量（TPC和TFC），持续12周，以预测储藏对饮料营养价值和抗氧化潜力的影响。数据显示TPC和TFC均显著下降，归因于氧化、酶活性、光照、温度和pH等因素，且随产品配方和储藏时间而变化。第0周初始TPC值为78.41至139.52 mg GAE/g，第4周降至71.34–135.49 mg GAE/g，第8周降至63.40–124.20 mg GAE/g，第12周降至59.63–119.3 mg GAE/g。TFC同样随配比和储藏时间下降：第0周为32.14至51.56 mg儿茶素/g，第4周降至27.04–40.56 mg儿茶素/g，第8周降至24.30–36.10 mg儿茶素/g，第12周降至22.20–33.14 mg儿茶素/g。TPC和TFC持续下降至第8周，此后多数产品的降幅变得不显著。这一模式可解释为较不稳定的酚类和黄酮类化合物在储藏早期优先降解，一旦这些活性化合物大部分耗尽，进一步损失的速率减慢，导致第8周后水平相对稳定。根据Parveen，除营养益处外，总酚和总黄酮因其强抗氧化和抗菌活性而有助于食品保藏和货架期延长，通过抑制氧化降解和抑制腐败微生物来维持食品质量。M. stenopetala含量较高的开发产品即使在12周后仍保持较好的TPC和TFC水平。由于TPC和TFC可防止氧化降解和微生物生长，这些产品预期表现出延长的货架期，同时保持良好营养和感官品质。在抗氧化活性方面，DPPH清除试验测定自由基中和能力，FRAP试验评价对铁离子的还原能力。结果显示DPPH和FRAP值在储藏期间均显著下降，取决于甘蔗与M. stenopetala配比和储藏时间。第0周初始DPPH值为58.88%–88.45%，第4周降至48.97%–80.58%，第8周降至40.36%–71.35%，第12周降至38.56%–68.62%。FRAP值呈相似模式：第0周22.64–67.10 mg BHTE/g，第4周降至15.66–60.10 mg BHTE/g，第8周降至12.25–53.63 mg BHTE/g，第12周降至11.05–51.32 mg BHTE/g。由于DPPH和FRAP与TPC和TFC直接相关，其下降反映了TPC和TFC的下降，由氧化、酶活性、光照、温度、pH和储藏时间驱动。DPPH和FRAP值持续下降至第8周，与TPC和TFC的下降趋势密切平行；第8周后多数产品的进一步下降变得不显著。这一模式归因于较不稳定的酚类和黄酮类化合物在储藏早期优先降解，一旦这些活性化合物大量耗尽，进一步损失速率减慢，导致第8周后抗氧化水平相对稳定。含20%或以上M. stenopetala的产品CM6–CM10在12周后仍保持50%以上DPPH清除率和较强FRAP值。由15% M. stenopetala和15%麦芽配制的CM7在12周后也超过50% DPPH并显示良好FRAP，表明麦芽是有价值的抗氧化来源。这些饮料中抗氧化活性的储藏效应与相关功能性饮料研究结果一致。Rather等开发了大豆乳清-菠萝汁，观察到在常温和冷藏储藏30天内酚类、黄酮类和DPPH活性下降，与本研究结果一致。Tripathi等配制了苹果基混合饮料（苹果-橙-桃、苹果-樱桃和苹果-沙棘），报告从生产到储藏3个月期间酚酸、花青素和DPPH自由基中和能力下降，与本研究结果一致。

在微生物稳定性与货架期方面，研究人员每4周评估一次所开发饮料的微生物质量，持续12周，以评价储藏对食品安全和货架期的影响。总细菌（TB）计数在各分析轮次间存在差异，受配比和储藏时间影响。第0周，由于卫生加工以及灌装、气密玻璃瓶包装后巴氏杀菌，所有产品均未检测到TB生长。到第4周，大多数配方出现TB，计数随甘蔗与M. stenopetala比例和麦芽含量而变化，较高的甘蔗和麦芽水平支持微生物生长而抗菌保护有限。值得注意的是，第4周在由70%甘蔗、25% M. stenopetala和5%麦芽制备的CM9以及由70%甘蔗和30% M. stenopetala制备的CM10中未检测到TB，可能因为较高M. stenopetala比例具有更强抗菌特性。与第4周（TB计数0–19 CFU）相比，第8周显著增加（25–116 CFU），反映细菌增殖、储藏期间抗菌活性下降以及甘蔗和麦芽的生长促进作用。到第12周，由于细菌持续增殖和抗菌效力进一步丧失，所有产品的TB计数进一步升高。M. stenopetala含量较高的产品TB计数始终低于含量较低或不含M. stenopetala的产品。相对于EPHI标准，所有10种产品在第4周TB方面均安全可食用；第8周仅CM1和CM2超过标准而不安全，CM3–CM10仍在EPHI限值内；到第12周所有产品均超过EPHI标准，表明腐败且不适合食用。酵母/霉菌计数呈与TB相似的模式，随配比和储藏时间变化。第0周因卫生加工及灌装、气密玻璃瓶包装后巴氏杀菌未观察到生长。到第4周，大多数产品样品中酵母占优势，M. stenopetala比例较高的配方菌落计数最低，100%甘蔗制备的CM1最高，反映M. stenopetala的抗酵母/霉菌活性和甘蔗对酵母/霉菌生长的适宜性。根据菌落形态，早期以酵母菌落为主，而霉菌从第8周起占优势，可能因为初始简单糖支持酵母，但较长储藏导致酸性或酒精发酵，霉菌耐受并持续生长。酵母/霉菌计数从第4周2–12 CFU显著增至第8周6–26 CFU，到第12周达24–69 CFU，原因是酵母/霉菌增殖和储藏期间抗菌效果下降。与EPHI标准比较，第4周除CM1超过EPHI限值外所有产品均安全；第8周CM1–CM5超过EPHI标准而不安全，CM6–CM10仍可接受；到第12周所有产品均超过EPHI标准，表明腐败且不适合食用。大肠菌群检测评价常温储藏期间的卫生质量和致病风险。第0周和第4周所有产品均未检测到大肠菌群，归因于卫生加工及灌装、气密玻璃瓶包装后巴氏杀菌。大肠菌群首次出现在第8周的CM1–CM5和CM7，这些产品甘蔗比例较高、抗菌潜力较低；相比之下，CM6、CM8、CM9和CM10（20%–30% M. stenopetala）未检出大肠菌群，与M. stenopetala更强的抗菌特性一致。到第12周，由于抗菌活性逐步丧失，所有产品均出现大肠菌群。EPHI要求即饮饮料完全不得检出大肠菌群，所有产品在第0周和第4周符合该要求；第8周CM6和CM8–CM10仍安全，但CM1–CM5和CM7不安全；到第12周所有10种产品因大肠菌群存在而不安全。

本研究证明，在甘蔗-麦芽饮料中加入20%–30% M. stenopetala叶提取物可通过维持抗氧化能力和抑制微生物增殖显著增强储藏性，从而在常温储藏条件下将货架期延长至8周。相比之下，M. stenopetala叶提取物含量低于20%的配方货架期短于8周。在所开发产品中，CM8–CM10配方在储藏8周后显示出良好的微生物安全性和稳定性。这些结果突显了M. stenopetala叶提取物因其强抗氧化和抗菌特性而作为天然防腐剂的有效性。若要将保藏期延长至8周以上，可考虑添加柠檬酸、山梨酸盐、苯甲酸盐或二氧化碳等辅助防腐剂。然而，仍需开展扩大重复次数、包括全面理化、色泽和感官评价的进一步研究，以充分证实这些发现并确认8周常温货架期内的消费者可接受性。