《Communications Biology》：FAK- and TGF-β1-dependent biomechanical alterations in microvascular endothelial cells exposed to fluid shear stress gradients
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内皮细胞（EC）形成动态单层屏障，调控血管通透性，并对机械线索高度敏感，包括血流产生的剪切应力（SS）。尽管空间剪切应力梯度（SSG）与动脉粥样硬化等血管病理相关，但其对不同EC亚型细胞生物力学的直接影响仍研究不足。本研究利用兼容视频显微镜的撞击流装置，证明两
内皮细胞（EC）形成动态单层屏障，调控血管通透性，并对机械线索高度敏感，包括血流产生的剪切应力（SS）。尽管空间剪切应力梯度（SSG）与动脉粥样硬化等血管病理相关，但其对不同EC亚型细胞生物力学的直接影响仍研究不足。本研究利用兼容视频显微镜的撞击流装置，证明两种EC暴露于SSG后，迁移速度立即且持续下降两倍，同时集体运动协调性增强并出现逆流方向迁移。与此同时，EC牵引力和单层应力在流动开始时急性增加，并随时间线性持续上升。机制上，FAK介导的机械转导调控逆流迁移，而牵引力的时间依赖性增加依赖于TGF-β1信号和肌动球蛋白收缩性。总之，这些发现确定SSG是EC力学、集体动力学和信号传导的关键调控因素，对血管疾病的诊断和治疗具有重要意义。
研究背景方面，内皮细胞（EC）衬于血管内腔形成单层，作为选择性屏障调控分子运输并限制病原体扩散。EC持续感知血流产生的剪切应力（SS），调控血管生成、血管重塑及疾病进展。与大血管EC经历相对均匀的血流不同，毛细血管网络中的微血管内皮细胞（μEC）暴露于高度异质的血流环境，其特征为陡峭的空间剪切应力梯度（SSG）。这些梯度自然产生于血管分叉或弯曲处，也可由动脉粥样硬化等病理条件引起。然而，大多数内皮机械生物学研究集中于暴露于均匀SS的大血管EC，μEC对SSG的响应研究相对不足。此外，μEC中S1P-S1PR1轴和剪切相关钙信号已被鉴定为流量诱导SSG响应的分子调控因子，但细胞通过细胞骨架和黏着斑动力学变化产生的力如何贡献于趋流性，以及类似的力依赖机制是否在其他μEC亚型中运作尚不清楚。鉴于μEC在伤口愈合、血管生成和屏障功能中的重要作用，阐明这些细胞响应血流的机械敏感性迁移模式至关重要。本研究利用撞击流装置研究SSG如何影响μEC生物力学，发现SSG关键调控EC趋流性，μEC以FAK依赖方式逆流迁移，通过响应TGF-β1增加牵引应力。
研究人员开展了以下研究：使用人真皮μEC（HMEC-1）并在人脑μEC（hCMEC/D3）中验证关键发现，利用撞击流装置施加流动同时进行视频显微镜记录。研究得出以下结论：SSG使μEC迁移速度降低约两倍并增强运动协调性；μEC逆流趋性响应SSG而非恒定SS；流动停止后迁移速度部分恢复但趋流方向性持续；μEC牵引力和单层应力随流动持续线性增加；SSG上调黏着斑、细胞骨架和TGF-β1相关基因表达；FAK抑制逆转μEC趋流性而ROCK抑制仅减慢迁移；TGF-β1驱动μEC牵引力增强但不影响趋流响应。这些发现的重要意义在于将空间SSG定位为μEC行为的关键决定因素，能够重编程细胞运动学和动力学，并以EC类型依赖方式诱导超越流动暴露期的持续机械变化，有助于解释血管疾病中观察到的内皮表型空间异质性。
关键技术方法方面，研究人员使用撞击流装置在多孔玻璃底板培养的EC单层上施加3 mL/min流速产生SSG，同时进行延时相差显微镜记录（每10分钟采集）。利用牵引力显微镜（TFM）在3 kPa聚丙烯酰胺水凝胶上测量细胞牵引应力，利用单层应力显微镜（MSM）计算单层应力。通过RNA测序分析流动暴露20 h后的转录组变化，使用KEGG通路富集分析鉴定差异调控通路。通过免疫荧光染色检测F-actin、磷酸化肌球蛋白轻链（pMLC）、vinculin和Ki-67。使用药理学抑制剂PF-573228和FAK-14（FAK抑制）、Y-27632（ROCK抑制）、SB-525334和LY-364947（TGF-β受体抑制）以及重组TGF-β1进行干预实验。样本来源为HMEC-1（Welch实验室赠送）和hCMEC/D3（Morrison实验室赠送）永生化细胞系。
研究结果方面，首先，SSG暴露降低μEC迁移速度同时增强集体运动。通过撞击流装置施加流动并结合视频显微镜记录，发现流动导致μEC迁移速度约降低两倍，且在20 h记录期间保持稳定，同时伴随细胞运动协调性显著增强。静态条件下两种μEC均显示随机迁移。流式细胞术显示流动条件下HMEC-1密度较静态对照低23%，Ki-67免疫染色显示流动暴露细胞增殖减少。相关长度分析显示流动暴露的两种μEC相关长度较静态条件增加两倍。这些结果表明撞击流装置流动暴露增加μEC迁移协调性同时降低并稳定迁移速度。
其次，单层μEC响应流动驱动SSG发生逆流趋性。利用撞击流的轴对称特性，研究人员量化了平均径向细胞位移（ur）作为距射流中心距离和时间的函数，以kymograph表示。静态条件下两种μEC显示无净方向偏倚的随机迁移。流动暴露期间，两种μEC系一致表现出逆流趋性，HMEC-1响应更快（0-5 h内）且趋流性强于hCMEC/D3（5-10 h内）。HMEC-1趋流性在距射流中心370-555 μm区域达到峰值。固定样本成像显示高SSG区域核密度较静态对照增加约20%。使用平行流通道施加恒定SS（10和40 dynes/cm2）时，细胞迁移方向或速度无变化，表明空间SSG而非恒定SS是诱导μEC逆流趋性所必需的。
第三，流动停止后μEC迁移速度部分恢复而趋流方向性持续。研究人员对HMEC-1先静态成像5 h，随后流动暴露20 h，再停止流动后成像至少10 h。流动开始时迁移速度快速持续下降且细胞逆流迁移。流动停止后迁移速度随时间部分恢复，但细胞继续沿原流动反方向定向迁移，表明逆流趋性持续存在。相关长度在流动期间增加且在流动停止后仍显著高于从未暴露于流动的对照细胞。hCMEC/D3显示类似行为。这些结果表明SSG急性抑制μEC迁移速度但诱导持续趋流性和集体迁移状态，提示μEC保留先前流动暴露的机械记忆。
第四，μEC响应流动驱动SSG持续增加牵引力和单层应力。研究人员在3 kPa水凝胶上进行TFM，发现流动暴露后HMEC-1单层立即增加牵引应力和应变能约20%，随后在整个流动暴露期间牵引应力和应变能持续线性增加，20 h记录结束时应变能增加约80%。流动停止后HMEC-1继续施加升高的牵引应力（至少持续10 h）。hCMEC/D3显示类似机械响应但流动停止后应变能恢复至近流动前水平。静态对照EC单层牵引应力和应变能在记录期间保持稳定。MSM显示两种EC单层拉伸应力在流动暴露期间均增加，但仅在HMEC-1中流动停止后仍显著升高。这些数据表明EC运动学与动力学之间存在复杂联系，μEC通过增加牵引力和单层应力并降低速度来集体尝试逆流趋性。
第五，SSG上调μEC中黏着斑、细胞骨架和TGF-β1相关基因表达。免疫染色显示流动暴露μEC中F-actin应力纤维增强、pMLC沿应力纤维定位增加、vinculin向基底黏着斑重新分布。RNA测序显示流动暴露诱导两种细胞类型显著转录重塑：HMEC-1有156个上调基因和146个下调基因，hCMEC/D3有195个上调基因和239个下调基因。PCA显示EC类型是转录组变异的主要决定因素（52%方差），流动暴露是第二影响因素（13%方差）。KEGG通路分析揭示黏着斑信号、细胞骨架调控通路（PI3K-AKT和Hippo）和TGF-β1信号等通路共同受流动调控。炎症相关通路如NF-κB在流动期间被抑制。142个共同差异调控基因中11个编码ECM重塑相关蛋白，23个与TGF-β1信号相关。差异表达基因包括THBS1、JUNB、PDGFB、SMAD7、IL11和PTGS2上调，CAV1和Rac2下调。这些转录组分析表明黏着斑重塑、细胞骨架重组和TGF-β1信号可能是μEC适应流动诱导SSG的核心驱动因素。
第六，FAK抑制逆转μEC趋流性而ROCK抑制仅减慢迁移。为扰动黏着斑信号，HMEC-1在视频显微镜记录前2 h使用FAK抑制剂PF-573228处理。FAK抑制既不抑制流动前牵引力产生也不抑制流动暴露时牵引力增加及随后线性增加。然而牵引黏着更新显著减慢并伴随迁移速度降低。PF-573228处理细胞未能表现逆流趋性，反而顺流迁移。FAK-14同样损害逆流趋性。为检查肌动球蛋白收缩性贡献，HMEC-1使用ROCK1/2抑制剂Y-27632处理，显著降低细胞牵引应力 magnitude。流动暴露时Y-27632处理细胞仍观察到牵引力立即增加，但牵引力 magnitude在流动暴露期间保持不变。牵引黏着更新也显著降低。Y-27632处理使平均迁移速度降低约50%，但ROCK抑制细胞保留逆流迁移能力（速度降低）。这些结果表明FAK信号和肌动球蛋白收缩性在μEC趋流性中扮演不同角色：肌动球蛋白收缩性仅调控逆流趋性速度，而FAK信号是趋流方向性所必需的。
第七，TGF-β1驱动μEC流动期间牵引力增强且独立于趋流响应。静态条件下重组TGF-β1处理HMEC-1单层诱导牵引力 magnitude随时间渐进增加，20 h后应变能增加约300%。使用SB-525334抑制TGF-β1信号不改变初始急性牵引应力增加但消除流动期间牵引应力线性增加。结构不同的TβRI抑制剂LY-364947同样抑制渐进性牵引力增强。TGF-β1信号抑制不影响平均迁移速度或逆流趋性行为。这些结果表明TGF-β1信号是流动下μEC牵引力渐进增加所必需且充分的，但该增加对逆流趋性非必需，提示流动暴露期间牵引力增强和趋流性可能由不同机械转导通路调控。
讨论部分总结：研究人员报告两种不同μEC类型（真皮来源和脑来源）响应SSG急性减慢并增加运动协调性同时表现逆流趋性。该响应伴随牵引力和单层应力的立即时间依赖性线性增加。流动诱导的运动学响应在两种μEC中持续至流动停止后至少10 h，细胞继续沿流动暴露期间建立的方向迁移。相比之下，动力学的持续性具有细胞类型依赖性：HMEC-1维持升高的牵引应力而hCMEC/D3在流动停止后大幅恢复至静态水平。因此，先前流动暴露在μEC行为上留下持久印记，尽管其在细胞动力学层面的表现因EC类型而异。急性牵引应力增加独立于ROCK介导的收缩性或FAK依赖的黏着强化，可能涉及机械敏感元件如PECAM-1/VE-cadherin/VEGFR2复合物或机械敏感离子通道（如Piezo1）的参与。μEC表现急性但持续迁移速度降低伴随集体运动协调性增加，这些快速运动学和动力学响应不同于EC对流动的较慢形态适应。FAK信号编码流动方向性的机制仍不清楚，可能涉及不对称黏着斑更新或其他机制。ROCK抑制细胞尽管应变能降低约10倍仍保留趋流性，表明牵引力 magnitude本身不决定逆流趋性是否发生。TGF-β1信号是流动诱导时间依赖性牵引应力增加的关键驱动因素，独立于逆流趋性。流动停止后部分响应持续，HMEC-1维持升高牵引应力至少10 h而hCMEC/D3大幅恢复，提示先前流动暴露可诱导跨EC类型不同的持续生物力学状态。机械记忆可能通过持续细胞内重编程或ECM重塑实现。两种μEC类型在其他响应中也存在差异，hCMEC/D3转录上对流动更敏感但流动停止后牵引应力快速恢复基线，提示血管床特异性差异。研究局限性包括两种细胞均为永生化EC系可能不完全重现原代内皮的连接和屏障特性；MSM在未涵盖整个单层的图像区域进行，边界条件为近似值。转录组分析揭示无流动条件下炎症和抗病毒响应通路（包括干扰素信号、NF-κB、JAK-STAT和NOD样受体信号通路）上调，强调剪切流维持内皮稳态的关键作用。总之，研究将空间SSG定位为μEC行为的关键决定因素，能够重编程细胞运动学和动力学，并以EC类型依赖方式诱导超越流动暴露期的持续机械变化。这些见解有助于解释血管疾病中观察到的内皮表型空间异质性。
研究结论翻译：本研究结果表明，空间剪切应力梯度（SSG）是微血管内皮细胞（μEC）行为的关键决定因素，能够重编程细胞运动学和动力学，并以内皮细胞类型依赖的方式诱导超越流动暴露期的持续机械变化。这些见解有助于解释血管疾病中观察到的内皮表型空间异质性。
