《FEBS Letters》：How structural disorder and polyelectrolyte properties of prothymosin α enable its large interactome
编辑推荐：
Prothymosin α（ProTα）是一种在高真核生物中保守的、高度带负电荷的多功能多价蛋白质。该蛋白参与多种蛋白质复合物，并在其中表现出不同的结合模式。这些模式涵盖从通过短线性基序（SLiM）结合，到在与无序或折叠蛋白质形成的复合物中保持完全无序和高度动
Prothymosin α（ProTα）是一种在高真核生物中保守的、高度带负电荷的多功能多价蛋白质。该蛋白参与多种蛋白质复合物，并在其中表现出不同的结合模式。这些模式涵盖从通过短线性基序（SLiM）结合，到在与无序或折叠蛋白质形成的复合物中保持完全无序和高度动态。本综述重点阐述ProTα的物理化学性质如何促使其形成高亲和力动态复合物、通过三元复合物形成实现竞争性置换、复合凝聚（complex coacervation）以及多重特异性。研究人员着重介绍了ProTα在细胞核内外的功能，包括在细胞外空间中的功能，并描述了细胞应激如何重新分配ProTα的功能，使其作为警报素（alarmin）和免疫反应调节因子发挥作用。虽然ProTα的大多数结合伙伴高度带正电荷，与ProTα的负电荷相匹配，但其他结合伙伴并非如此，且许多与ProTα相互作用的分子细节仍然缺乏，这影响了研究人员对涉及生物聚电解质的相互作用中特异性的理解。
本文围绕Prothymosin α（ProTα）的聚电解质性质及其对广泛相互作用组的贡献展开综述。在引言部分，文章指出ProTα是高真核生物中一种多功能多价蛋白质，在体内发挥双重作用：在细胞内调节细胞增殖、染色质重塑、转录和细胞存活；在细胞外作为免疫调节剂，刺激先天免疫系统并赋予对机会性感染的抵抗力。ProTα在肺癌、结肠癌、肝癌和乳腺癌等癌症中过表达，并与加速病毒感染衍生疾病相关，因此其广泛的疾病关联使其成为潜在的药物靶点。ProTα由PTMA基因编码，是一种完全无序且高度保守的蛋白质，有110或111个残基两种同工型，分别携带?43或?44的高净负电荷，具有生物聚电解质的特征。ProTα含有核定位信号（NLS），在非应激条件下主要定位于细胞核。ProTα存在多种蛋白水解产物，包括N端片段胸腺素α1（Tα1）和C端片段ProTα100-109，后者在caspase-3/7介导的凋亡加工过程中产生，作为警报素从凋亡细胞释放。ProTα的翻译后修饰（PTM）包括N端区域多个体内检测到的磷酸化位点。文章指出，ProTα的水平与细胞增殖速率密切相关，已鉴定的结合伙伴从高度带正电荷的连接组蛋白H1.0到凋亡复合物和细胞外受体TLR4等，此外ProTα还含有多个二价金属离子结合位点。
在“ProTα是一种伸展且高度动态的聚电解质”部分，文章指出ProTα属于人类蛋白质组中仅3–5%完全无序的蛋白质。其序列中近50%由Asp和Glu残基组成，使其在近中性pH下高度带负电荷。生物物理技术包括圆二色谱（CD）、核磁共振（NMR）波谱、小角X射线散射（SAXS）和单分子F?rster共振能量转移（smFRET）已证明ProTα在近生理条件下不 adopt 任何明确的三级或二级结构。高负电荷导致ProTα伸展，SAXS测定的回转半径（Rg）为3.7 ± 0.2 nm，NMR和双焦点荧光相关光谱（FCS）测定的流体动力学半径（Rh）为2.89 ± 0.08 nm。链尺寸强烈依赖于盐浓度。由于电荷排斥和无结构特征，ProTα具有显著的动态性，FCS测量揭示链重构时间约为20至80 ns。NMR自旋弛豫实验揭示均匀且低的横向弛豫速率。ProTα缺乏结构和高度动态的特征对其相互作用具有重要影响：聚电解质性质和构象适应性允许其与带相反电荷的无序蛋白质形成高度无序的复合物；无序相互作用的性质促进形成多种化学计量比的复合物；无序和多价性还可导致通过复合凝聚发生相分离。
在“ProTα在细胞核中的功能和相互作用”部分，文章介绍了ProTα通过经典核输入途径以ATP依赖方式被主动转运入核。ProTα特异性结合Rch-1，后者是Importin α的一种特定同工型，通过经典NLS识别SLiM K[KR]X[KR]。ProTα的C端存在由残基89KR90和102TKKQKT107组成的双分NLS SLiM，负责其核转运。在染色质重塑小节中，文章指出ProTα以H1分子伴侣的角色发挥作用，促进H1从核小体解离，从而使染色质去浓缩并促进转录。ProTα与H1的相互作用通过CD、NMR和单分子光谱及分子动力学（MD）模拟进行了表征，揭示在近生理条件下两者形成皮摩尔至纳摩尔解离常数的高亲和力复合物，以高度动态的快速互变构象集合形式存在，没有残基特异性接触或明确的结合界面。该相互作用主要由两条链上带相反电荷残基之间广泛分布的静电相互作用主导，接触寿命仅为几纳秒。ProTα:H1复合物的表征扩展了已知蛋白质相互作用谱，代表了蛋白质复合物有序-无序连续谱中无序极端的一端。文章还描述了ProTα与H1球状结构域（H1-GD）之间类似的动态无序复合物。ProTα与H1的相互作用与带相反电荷合成聚合物形成的聚电解质复合物具有若干相似之处。依赖于蛋白质浓度、离子强度和电荷化学计量比，ProTα和H1可形成从多化学计量比的可溶性复合物到相分离的复合凝聚体的多种组装体。在递增的生理相关蛋白质浓度下，这种结合模式能够形成瞬时三元复合物，进入的分子通过称为竞争性置换的机制取代预结合的伙伴。三元复合物的短寿命（约0.5 ms）将结合与未结合群体之间的分子交换加速50倍以上。这些动态特性可能对ProTα作为H1分子伴侣的生物学功能至关重要。在转录调控小节中，文章指出ProTα通过免疫共沉淀（co-IP）和细胞共定位被证明与甲基CpG结合域蛋白3（MBD3）相互作用，驱动原代心肌细胞增殖。MBD3是核小体重塑和去乙酰化酶（NuRD）复合物的非DNA结合亚基。ProTα过表达干扰MBD3:组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）相互作用，从而损害NuRD复合物的组织并抑制HDAC1的去乙酰化活性。此外，该研究还鉴定STAT3为ProTα的结合伙伴。在细胞核中，ProTα与p300和CREB结合蛋白（CBP）相互作用，后两者是具有组蛋白乙酰化酶活性的转录共激活因子。通过co-IP、谷胱甘肽S-转移酶（GST）pull-down实验、细胞共定位以及使用酸性肽的竞争实验确认了ProTα与CBP/p300的结合。缺失研究将ProTα的结合定位到CBP/p300高度带正电荷的CH1（TAZ1）和CH2（TAZ2）结构域。通过这些相互作用，ProTα刺激CBP的组蛋白乙酰转移酶（HAT）活性，促进组蛋白乙酰化和转录激活。在应激信号调控小节中，文章指出Keap1是转录因子Nrf2的重要调节因子。酵母双杂交、co-IP和pull-down实验证明ProTα直接结合Keap1，结合位点位于Keap1的C端Kelch结构域，与Nrf2结合界面重叠。体外竞争实验进一步表明ProTα以剂量依赖方式从Keap1置换Nrf2。晶体结构结合NMR和热力学数据揭示了ProTα与Keap1基于SLiM的结合模式，ProTα中的SLiM 43ENGE46与Nrf2中的ETGE SLiM非常相似，但两者对Keap1的结合亲和力存在较大差异（ProTα 3 μm；Nrf2 38 nm）。ProTα还与Smad7相关联，后者是TGF-β活性的抑制蛋白。ProTα与Smad7相互作用以防止其泛素介导的降解，并可招募p300等乙酰转移酶增加Smad7赖氨酸残基K64和K70的乙酰化。
在“ProTα在细胞质和细胞外空间的功能和相互作用”部分，细胞存活与凋亡小节指出ProTα通过抑制凋亡体形成和 consequently 抑制caspase-9和caspase-3激活发挥抗凋亡功能。多项研究提出ProTα直接结合凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）单体，从而通过阻止Apaf-1寡聚化抑制凋亡体组装。NMR分析支持ProTα与Apaf-1之间的直接相互作用。ProTα还与转录共调节因子核蛋白1（NUPR1）相互作用，后者是一种小型带正电荷蛋白（+5），富含精氨酸残基，有助于通过转录调控抑制caspase激活。在凋亡后期激活步骤中，ProTα成为caspase-3的底物，在保守的C端98DDVD101基序处被切割。最近一项研究发现ProTα通过维持线粒体完整性对持续应激条件下CD8+ T细胞存活具有重要作用，共定位、邻近连接实验和co-IP实验证明ProTα直接与线粒体转录因子A（TFAM）相互作用以保护线粒体DNA完整性。在细胞外信号转导与应激响应小节中，文章指出ProTα尽管缺乏信号肽，但也已被报道在细胞应激响应中作为细胞外信号分子发挥作用。细胞外ProTα可通过与TLR4相互作用激活信号转导途径，促进免疫激活和应激适应反应，作为危险相关分子模式（DAMP）发挥作用。生物物理证据结合重量分析法和MD模拟获得了ProTα与TLR4结合的 evidence。ProTα主要通过其带负电荷的C端区域与TLR4及其共受体髓样分化蛋白2（MD-2）相互作用。细胞外ProTα已被报道具有抗缺血功能。在缺血应激期间，ProTα从神经元和星形胶质细胞快速释放，在那里抑制细胞死亡。在神经细胞中，缺血期间ATP耗竭和Ca2+内流导致ProTα胞质滞留，在那里它以Ca2+依赖方式与S100A13相互作用。在抗病毒活性小节中，文章指出ProTα的抗病毒活性最初在将CD8+ T细胞培养基来源的外源性蛋白加入巨噬细胞后抑制HIV-1进入后复制时被证明。机制研究确立ProTα为TLR4的配体，激活TRIF依赖信号诱导I型和III型干扰素以及MyD88依赖信号产生促炎细胞因子。此外，ProTα还刺激趋化因子RANTES的表达。Pull-down实验表明ProTα结合HIV-1无序Rev蛋白核输出序列中保守的亮氨酸基序LPPLERLTL，该结合在Zn2+和Ca2+存在下增强。ProTα显示抗病毒功能的最小区域定位到残基50–89。然而，最近一项研究揭示了ProTα在登革病毒感染中的致病作用。
在“ProTα结合中的特异性”部分，文章指出ProTα可被表征为生物聚电解质，其高度带电且固有无序性质能够形成高度动态的复合物、多化学计量比复合物以及复合凝聚体。ProTα远非细胞中唯一带负电荷的聚电解质蛋白质，Dss1/Sem1、HMGB1、ANP32A/B/E和Nap1等蛋白质均携带高度带负电荷的区域。对于ProTα，许多结合伙伴带正电荷，或者尽管整体净电荷为负，但暴露局部高度带正电荷的表面斑块。因此，静电相互作用在塑造ProTα相互作用组中发挥主导作用。然而，这些似乎支持ProTα多功能性的静电性质也提出了一个基本问题：像ProTα这样的高度带电IDP如何实现靶标选择性和特异性。越来越多的研究表明IDP的净电荷和电荷模式影响其构象集合以及相互作用的亲和力和特异性。例如，在ProTα和H1之间交换电荷或重新分配电荷会显著改变它们的结合亲和力。在ProTα与带正电荷的折叠H1-GD的动态复合物中，结合亲和力可通过改变H1-GD的净电荷以及其折叠表面上电荷聚集的程度来调节。调节这些参数的一种方式是通过PTM，包括磷酸化和乙酰化，以及通过蛋白水解。除了调节蛋白质-蛋白质相互作用的可能性外，蛋白质浓度的变化还强化了由ProTα等蛋白质的聚电解质性质所赋能的结合机制。文章最后指出，尽管由ProTα的聚电解质性质赋能的静电相互作用似乎代表了主导结合模式并支持其许多生物学功能，但它们并不能完全解释ProTα的相互作用组。根据结合伙伴的不同，结合可能源于互补的物理化学性质，包括净电荷和电荷模式、局部SLiM，或两者的组合。ProTα:H1复合物代表了电荷驱动相互作用的极端例子，没有形成持久的残基特异性接触，而与Keap1的相互作用依赖于通过结合Kelch结构域口袋内的SLiM E(x)GE获得的更传统的残基特异性接触。因此，ProTα并不依赖于单一的结合模式。在结论与展望部分，文章总结ProTα仍然是表征最充分的生物聚电解质之一，过去10年对ProTα的研究发现了复杂的分子性质并推动了对蛋白质相互作用的重新思考，将有序-无序连续谱推向极端。鉴于ProTα与疾病的众多联系，探索ProTα用于疾病治疗似乎高度相关，但基于IDP的治疗干预也是一项极其艰巨的任务。
