《Food Frontiers》：Microalgae Proteins for Sustainable Food Systems: A Comprehensive Review of Advanced Extraction Technologies, Functional Performance, Bioactivity, and Industrial Translation
微藻因其高蛋白含量、均衡的氨基酸组成、快速的生物质生产率以及较低的土地和淡水需求，已成为技术可行性最高的可持续蛋白来源之一。本综述对富含蛋白的微藻进行了全面评估，包括Limnospira（Spirulina）、Chlorella、Microchloropsis、Tetraselmis及其他具有商业相关性的物种。研究将常规提取方法（溶剂法、酸法、碱法、机械法和热法）与非常规及先进技术进行了批判性比较，后者包括超声辅助提取（UAE）、微波辅助提取（MAE）、酶辅助提取（EAE）、脉冲电场（PEF）、高压处理（HPP）、亚临界水提取（SWE）、深共熔溶剂（DESs）、离子液体（ILs）、膜分离以及集成生物精炼（integrated biorefinery）策略。文中详细讨论了提取技术对蛋白得率、纯度、功能性和生物活性的影响。功能特性，包括溶解度、持水与持油能力、乳化性、起泡性和凝胶性，与新兴的健康促进作用（如抗氧化、抗炎、抗高血压及肠道调节活性）一并得到评价。本综述进一步探讨了当前限制大规模商业化的安全性、法规、感官、可持续性及技术经济等方面的考量。最后，未来展望强调了集成生物精炼、低溶剂工艺以及人工智能驱动的过程优化在加速微藻蛋白产业化应用中的作用。
1 Introduction
全球食品体系正面临多重压力叠加：预计2050年人口接近100亿、集约化动物养殖带来的环境退化加剧、淡水资源减少以及人均优质膳食蛋白需求上升。这些挑战推动了对替代蛋白来源的寻找，要求其在单一生产体系中同时实现营养充足性、功能性能与环境可持续性。在候选来源中，豆类、昆虫、真菌与细胞农业中，微藻凭借极高的生物质生产率、组成丰富性和培养灵活性脱颖而出，为常规作物体系所不及。
文章首先界定了术语使用：微藻作为伞形术语，涵盖真核微藻与光合原核蓝细菌；在涉及分类学区分时，蓝细菌特指原核类群，真核微藻则指绿藻门（Chlorophyta）、硅藻门（Bacillariophyta）、红藻门（Rhodophyta）和定鞭藻门（Haptophyta）等类群。相应地，Limnospira作为商品名为Spirulina的生物在分类学上的属名，Spirulina仅在指代通用商品名或复述文献术语时保留。微藻的光合效率据报为陆生作物的3–10倍，可在封闭光生物反应器或开放跑道池中利用盐水、微咸水或废水流培养，并可同时固定工业CO2排放。其生物质组成丰富，蛋白含量占干重（DW）的20%–70%，并含多不饱和脂肪酸（PUFAs）、色素、维生素和多糖。
从蛋白角度看，L. platensis含55%–70%粗蛋白（DW），超过豆粕并可媲美干蛋清；Chlorella vulgaris具有均衡的必需氨基酸（EAA）组成，赖氨酸和蛋氨酸含量具有营养学意义。经加工的Spirulina和Chlorella的蛋白消化率校正氨基酸评分（PDCAAS）为0.75–0.94，与多种豆类蛋白相当，并在有效破壁后显著提升。生命周期评价（LCA）研究显示，Chlorella培养每千克蛋白的温室气体排放比家禽低50%–70%，比牛肉低达90%。
然而，微藻从实验室对象向可规模化食品配料的转化受制于一系列持续性技术、经济与法规挑战。许多商业相关物种具有刚性细胞壁，从Chlorella的纤维素壁到Haematococcus pluvialis的类孢粉素结构，构成蛋白可提取性的显著障碍，需在下游加工前进行有效破壁。常规提取方法各有其在蛋白得率、功能品质与工艺可放大性之间的权衡。这些方法已逐步被非传统技术补充，包括UAE、MAE、EAE、PEF、HPP和SWE，其具有更高的能效、选择性和对蛋白生物活性的保护作用。
更新一代的先进技术进一步拓展了提取工具箱。DESs和基于ILs的体系提供可调控的溶剂化性质并相对常规有机溶剂具有更低的毒理学特征。膜分离平台可实现规模化高纯度蛋白浓缩与分级分离，而纳米技术辅助方法和超临界流体提取（SFE）引入了新的选择性机制。集成生物精炼概念通过依次级联提取蛋白、脂质、色素和碳水化合物以最大化总生物质价值化，被视为商业微藻蛋白生产最有效的经济框架。在上述技术发展之上，人工智能与机器学习方法日益应用于优化多变量提取体系，加速全局最优工艺参数的识别。
在提取之外，微藻蛋白的功能特性——溶解度、持水与持油能力（WHC和OHC）、乳化性、起泡性和凝胶性——决定其在食品体系中的实际效用及相对既有植物与动物蛋白的竞争力。同时，越来越多证据记录了微藻来源蛋白与肽的显著生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗高血压、抗菌、免疫调节和促进肠道健康活性，使其成为功能性食品与营养保健品应用的多功能配料。但实现这一潜力需应对复杂的法规环境、处理与重金属污染、蓝藻毒素和致敏性相关的安全性问题，并制定克服感官挑战（尤其色泽、异味和消化性）的策略。
若干近期综述已分别涉及微藻蛋白研究的单一维度：用于生成技术功能配料的培养与下游加工策略、特定微藻物种的商业化前景，以及微藻作为可持续蛋白源的关键生产与应用问题。然而，尚无综述在单一、系统结构化的评估中整合从常规、非传统与新型提取技术的比较评价，到功能表征、生物活性与健康促进特性、食品应用案例以及安全、法规、感官与技术经济考量的全价值链。这一空白具有重要意义，因为提取技术选择是下游功能与生物活性表现的主要决定因素，而这两个维度在现有文献中很少被一并评价。本综述通过提供对微藻来源蛋白研究现状的全面整合分析来填补这一空白，涵盖富含蛋白物种及其营养组成、常规与先进提取方法、功能与生物活性、食品应用案例、安全与法规考量以及可持续性与技术经济视角。
1.1 Literature Search Methodology
本综述遵循结构化文献检索与筛选策略，以确保全面覆盖微藻蛋白提取、功能性、生物活性与工业应用的最新进展。检索使用Scopus、Web of Science、ScienceDirect和PubMed四个主要数据库，纳入2013年至2026年6月发表的文献，并在其提供微藻蛋白与生物精炼概念基础信息时纳入若干里程碑式出版物。检索采用关键词组合，包括微藻蛋白、蛋白提取、UAE、EAE、PEF、HPP、DESs、生物精炼、功能特性、生物活性肽和可持续蛋白，并使用布尔运算符（AND、OR）精炼检索。初检共获642条记录，去除128条重复记录后余514篇进入题名与摘要筛选；随后排除342条（与食品蛋白无关、仅聚焦脂质或色素提取、会议摘要、专利、社论或缺乏充分实验信息）。剩余172篇全文文献进行资格评估，全文评价后排除50篇（方法学细节不足、与蛋白提取或功能性相关性有限、或与更全面研究报告的发现重复）。最终纳入122项研究，用于综合提取技术、功能特性、生物活性、可持续性与工业转化的证据。检索与筛选流程以流程图形式总结。
2 Overview of Protein-Rich Microalgae
2.1 Microalgae
微藻是栖息于淡水、海洋和高盐等多种水生与陆生环境的微小光合微生物，是地球上系统发育多样性最高的类群之一，涵盖原核蓝细菌与数千种已描述的真核藻类。其光合效率据报为陆生作物的3–10倍，可在适宜条件下快速积累生物质。其单细胞或简单群体组织使养分同化高效，带来极高生长速率与单位面积生物质生产率。与常规作物不同，微藻不需耕地，可利用非饮用水或盐水培养，并能以工业CO2排放为碳源。此外，微藻合成丰富的生物活性化合物，包括蛋白、PUFAs、色素、维生素和多糖。其在封闭光生物反应器或开放跑道池中的培养可实现全年受控生产；在自养、异养或混养条件下生长的能力进一步增加了常规生物质来源所不具备的灵活性。
2.2 Classification of Microalgae
微藻分类基于色素、细胞壁化学、贮藏产物和超微结构特征，反映其巨大的进化多样性。广义上，微藻分为原核微藻（蓝细菌，即蓝绿藻）和真核微藻，后者包括绿藻（Chlorophyta）、硅藻（Bacillariophyta）、红藻（Rhodophyta）、金藻（Chrysophyta）和甲藻（Dinophyta）等。蓝细菌（包括L. platensis）因其产氧光合作用和固氮能力在光合原核生物中占据独特地位。本综述优先使用Limnospira作为分类学名称，Spirulina仅在通用商品名或所引研究术语中保留。相比之下，C. vulgaris、H. pluvialis和Scenedesmus obliquus被视为Chlorophyta内的真核微藻。Bacillariophyta（硅藻）以硅质细胞壁（硅壳）和高脂质含量著称，Rhodophyta含藻红蛋白和藻蓝蛋白作为具强抗氧化性的辅助色素。Haptophyta（包括商业重要的Isochrysis和Microchloropsis物种）富含ω-3 PUFAs和蛋白。各分类门因细胞壁组成差异（从Chlorella的刚性纤维素壁到Spirulina的蛋白性S层）在蛋白提取上面临不同挑战与机遇，这从根本上决定提取效率与下游加工需求。
2.3 Major Protein-Rich Microalgae Species
若干微藻物种已被鉴定为可供工业开发的优异蛋白源。L. platensis（Spirulina）是商业化程度最高的微藻，蛋白含量为DW的55%–70%，超过大豆、肉类和乳制品。C. vulgaris含50%–60%蛋白（DW），EAA组成均衡，赖氨酸和蛋氨酸含量可观。Microchloropsis oceanica和Microchloropsis gaditana因脂质与蛋白双重生产潜力受关注，蛋白含量随培养条件为DW的28%–50%。Dunaliella salina主要培养用于β-胡萝卜素生产，亦含25%–35%蛋白（DW），并在高盐环境中生长、污染风险极低。H. pluvialis主要培养用于虾青素，蛋白含量为DW的25%–40%，在集成生物精炼概念中日益受到关注。Tetraselmis suecica和Porphyridium purpureum因其均衡营养组成在水产饲料中受重视，而S. obliquus和Desmodesmus sp.在废水培养条件下表现出稳健的蛋白生产率。蛋白提取的物种选择取决于蛋白含量、氨基酸组成、细胞壁结构、培养可放大性及与下游加工技术的兼容性。
2.4 Nutritional Composition of Microalgae
微藻的营养组成高度物种特异性，并受光照强度、温度、养分可利用性、CO2浓度和培养模式等生长条件深刻影响。总体而言，微藻生物质由蛋白（20%–70% DW）、脂质（5%–60% DW）、碳水化合物（5%–50% DW）和微量营养素（维生素B12、E、K，矿物质铁、锌、钙、镁及微量元素）组成。Spirulina尤其富含B族维生素、铁和γ-亚麻酸（GLA），而Microchloropsis物种是二十碳五烯酸（EPA，C20:5n-3）的主要来源。色素部分包括叶绿素、类胡萝卜素（虾青素、叶黄素、β-胡萝卜素）和藻胆蛋白（藻蓝蛋白、藻红蛋白），贡献额外的功能与营养保健价值。微藻在适当加工后消化性也较高，破壁后PDCAAS可与常规动物蛋白相当。微藻物种特异的氮-蛋白换算系数（4.78–6.25）日益用于更准确估算真蛋白含量，替代常规食品所用的通用6.25系数。理解完整营养基质对于优化提取工艺至关重要，以在最大化蛋白回收的同时保留共存具协同健康促进作用的生物活性化合物。
2.5 Protein Composition and Amino Acid Profile
微藻蛋白由结构蛋白（存在于细胞壁和膜中）、代谢酶和贮藏蛋白组成的复杂混合物构成，各具不同的溶解度、稳定性和功能特征。Spirulina蛋白主要为藻蓝蛋白（一种色素蛋白，占DW可达20%）以及多种酶和结构多肽。C. vulgaris蛋白包括高比例的叶绿体相关蛋白如RuBisCO，其构成总可溶性蛋白池的重要部分。综合氨基酸分析一致表明，主要富含蛋白的微藻物种含有全部九种EAA——组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸——其数量达到或超过FAO/WHO成人营养参考模式。Spirulina尤其富含亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，而C. vulgaris和Microchloropsis物种的赖氨酸和苏氨酸浓度优于植物蛋白基准。微藻蛋白的支链氨基酸（BCAA，亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸）含量对运动营养和肌肉蛋白合成应用尤具意义。含硫氨基酸（蛋氨酸+半胱氨酸）含量较低但具营养学意义。与大豆分离蛋白（SPI）相比，多数微藻蛋白EAA组成更均衡；与严重缺乏赖氨酸的小麦面筋相比，微藻显示出明显的营养优越性。经加工Spirulina（0.83–0.94）和Chlorella（0.75–0.88）的PDCAAS与豆类相当，且通过优化提取与加工可进一步改善。表中汇总了主要富含蛋白微藻物种的总蛋白含量与EAA富集情况，并注明内源性（非必需）氨基酸谱（如通常占主导的谷氨酸和天冬氨酸）在所引原始文献中未以物种比较为基础一致报告，被标记为未来组成表征的目标。
2.6 Comparison With Conventional Protein Sources
对可持续蛋白需求的增长加强了对微藻与常规蛋白源（大豆、小麦、豌豆、鸡蛋、酪蛋白和肉类）的比较评估。就粗蛋白含量而言，Spirulina和Chlorella超过豆粕（40%–50% DW蛋白），并在纯蛋白得率基础上可与干蛋清（80% DW蛋白）竞争。关键在于，微藻培养每千克蛋白所需土地和水显著更少：LCA研究报告Chlorella培养每kg蛋白的温室气体排放比家禽低50%–70%，比牛肉低达90%，且在海水或废水培养体系中无需淡水灌溉。动物模型中Spirulina补充的蛋白效率比（PER）据报为2.0–2.6，与酪蛋白（2.5）相当，显著高于小麦蛋白（0.9）。但微藻蛋白源也面临挑战，包括存在抗营养因子（如某些物种的胰蛋白酶抑制剂、重金属蓄积、Chlorella中高核酸含量），需适当加工与安全评价。完整微藻细胞的消化性受坚固细胞壁限制，但经加工的蛋白浓缩物和分离物消化性达80%–95%，缩小了与动物蛋白的差距。经济分析预测，在优化生物精炼情景下，大规模微藻蛋白生产有望到2030年实现与SPI的成本平价。
仅基于PDCAAS的营养品质评价可能高估微藻的实际蛋白品质，因为PDCAAS将单个氨基酸评分截断于最大值1.0，且未计入氨基酸特异的回肠消化率。可消化必需氨基酸评分（DIAAS）评价各EAA的真回肠消化率而不截断，提供更符合生理的评价，并表明完整微藻生物质的蛋白生物可及性显著低于PDCAAS值所暗示的水平，对具顽固细胞壁的物种尤为如此。因此，通过机械、酶法或热预处理实现有效破壁，是实现组成分析所指示营养潜力的前提，因为完整细胞显著限制胃肠酶接触胞内蛋白。抗营养因子进一步使营养评价复杂化：某些微藻物种的胰蛋白酶抑制剂、Chlorella的高核酸含量以及培养介质中的重金属蓄积，共同要求物种特异的加工与安全评价，而非泛化的营养优越性主张。因此，本综述其他处的营养主张应理解为适用于已证明破壁的加工蛋白浓缩物或分离物，并需限定所参照的消化率指标（PDCAAS与DIAAS），而非完整全生物质。
2.7 Harvesting of Microalgae Biomass
收获培养产生的生物质是所有下游蛋白提取前必要且技术上具有挑战性的一步。微藻细胞（2–50 μm）通常具有稳定的负表面电荷，阻碍自然沉降，且培养介质中生物质浓度低，意味着必须在提取前经济地浓缩大量稀培养液。常规收获方法包括重力沉降（低成本但缓慢，不适于缺乏自然絮凝倾向的物种）、离心（快速且近乎完全回收，但在商业规模高度耗能）以及溶气气浮和化学或生物絮凝（降低能耗但引入絮凝剂成本并可能污染回收生物质）。基于膜的过滤技术（包括微滤和超滤UF）日益被视为低能耗替代方案：比较性技术经济评价报告UF相对离心实现约7.7%更低的生物质回收成本和8.7%更高的生物质回收率。收获一直被认定为微藻生物质总生产成本的最大单项贡献者之一，凸显持续开发低能耗、可放大收获技术以改善微藻蛋白生产整体经济可行性的必要性。
2.8 Terminology: Forms of Microalgae Protein Ingredients
本综述讨论处于不同物料形态谱系的微藻蛋白，这些形态在组成、功能性和法规地位上差异显著。为清晰起见，全文采用以下定义：全生物质指完整的、未分级的微藻细胞（干燥或湿态），含蛋白及天然浓度的脂质、碳水化合物、色素和细胞壁物质；富蛋白生物质指为高蛋白含量而选育的物种或生长条件所得、未经组成分级的生物质；蛋白浓缩物指通过部分去除非蛋白组分使蛋白相对全生物质选择性富集的物料（通常60%–80%蛋白DW），同时保留可测的残余脂质、碳水化合物和色素；蛋白分离物指通过膜过滤等额外纯化获得的高纯蛋白物料（通常>90%蛋白DW）；水解物指经酶法或化学水解为较低分子量肽的蛋白浓缩物或分离物；生物活性肽指水解物中鉴定出的、 exert defined physiological effects的特定短链（2–20个氨基酸）序列。若所引原始文献未明确说明某研究所用物料形态，这代表原始来源的报告局限而非本综述的疏漏。
3 Conventional Protein Extraction Methods From Microalgae
在相关章节中报告了四个相关但不同的性能参数，文献中常统称为“蛋白得率（%）”，此处予以界定：提取得率（蛋白提取效率）为起始生物质中总蛋白被溶解进入提取介质的比例；蛋白回收率为下游纯化（如沉淀、过滤、离心）后最终级分中保留的粗提物蛋白比例；蛋白纯度为最终回收物料以其自身DW计的蛋白含量百分比，反映与共提取脂质、碳水化合物和色素的分离程度；可溶性蛋白回收率为在特定pH/离子强度条件下仍留在溶液中的总蛋白比例，与液体蛋白应用相关。由于这些参数在所引原始文献中未统一标准化，读者应查阅各原始来源报告的计算基础和分析方法（最常用Bradford、Lowry、BCA或燃烧/凯氏氮测定，采用4.78–6.25的物种特异氮-蛋白换算系数）。
3.1 Solvent Extraction
溶剂提取是从微藻生物质中回收蛋白及其他生物分子最古老、最直接的方法之一。该技术依赖蛋白在水性或含水醇溶剂中的差异溶解度，通常涉及用不同极性溶剂进行顺序提取步骤。乙醇、甲醇、丙酮和异丙醇被用于在水性蛋白提取前去除干扰性脂质和色素，从而提高提取物纯度。使用磷酸盐或Tris–HCl缓冲液在中性至微碱性pH（7–9）下的水性提取是破壁细胞可溶性蛋白回收的标准方法。尽管溶剂提取成本有效且可放大，但显著关切包括有机溶剂导致蛋白变性的风险、最终产物中残留溶剂污染以及选择性有限导致非蛋白生物分子共提取。溶剂法蛋白得率通常为总蛋白含量的45%–65%，效率高度依赖先前破壁程度。对食品级产品中残留有机溶剂的法规限制进一步限制了该方法在营养保健品和食品配料生产中的适用性。尽管有这些局限，溶剂提取仍广泛用作集成提取流程中的预处理步骤，尤其是在蛋白分离前对生物质脱脂。
3.2 Acid-Assisted Extraction
酸辅助提取利用蛋白在低pH值（通常2–4，使用盐酸HCl或硫酸H2SO4）下的差异溶解度。在酸性条件下，带正电的蛋白分子高度可溶，便于其在机械或化学破壁后从细胞基质中释放。该方法的关键特征是等电点沉淀：低pH提取后，将pH调至蛋白等电点（pI，多数微藻蛋白通常为pH 4–5）导致沉淀，从而通过简单离心回收富蛋白级分。酸辅助提取有效去除叶绿素、类胡萝卜素和其他色素，产生相对无色的蛋白浓缩物，适用于需要中性外观的食品应用。然而，长时间暴露于强酸和较高温度可导致不可逆变性、肽键水解、氨基酸消旋化以及功能特性（包括溶解度、凝胶性和乳化能力）损失。优化酸提取方案可实现50%–70%的蛋白得率，但酸性废物流的产生、中和成本以及强酸的腐蚀性构成显著工业局限。近期研究探索了弱有机酸（柠檬酸、乙酸）作为更蛋白兼容的替代品，在保持足够提取效率的同时减少变性。
3.3 Alkaline Extraction
碱提取是微藻蛋白回收最有效的常规方法之一，利用pH高于9时蛋白溶解度增加的特性，此时蛋白获得净负电荷，破坏聚集并促进其与细胞壁组分解离。使用氢氧化钠（NaOH）或氢氧化钾（KOH）在pH 9–12下溶解蛋白，随后通过调pH至蛋白pI进行等电点沉淀回收。碱性环境还促进膜脂皂化、细胞壁多糖水解和蛋白–多糖复合物破坏，共同增强蛋白可提取性。报告蛋白得率为55%–75%，最高得率在pH 11–12和中等温度（40–60°C）下观察到。一个关键缺陷是碱性条件易促进赖氨酸残基与还原糖之间的美拉德反应，损害蛋白功能性和营养品质。此外，强碱条件下形成的赖丙氨酸（一种高浓度下有毒的消旋副产物）引发食品安全关切。碱提取因简单和高得率而广泛应用于工业，但必须优化pH、温度和时间以平衡提取效率与蛋白品质保持。温和碱性条件（pH 9–10）日益被优先用于食品级微藻蛋白分离物生产。
3.4 Mechanical Extraction Methods
机械破壁方法通过物理方式破坏微藻刚性细胞壁以释放胞内蛋白，被视为多数下游提取方案的必需预处理步骤。珠磨是最具工业可放大性的机械方法，其中悬浮于液体中的微藻细胞在高速（2000–5000 rpm）下受玻璃、氧化锆或钢珠（0.3–1.0 mm直径）强烈研磨，实现60%–80%蛋白释放。破壁程度取决于珠径、装珠量、转速、停留时间和细胞浓度。高压均质（HPH）是另一种广泛使用的方法，细胞悬液在100–300 MPa压力下被迫通过窄孔，产生足以破坏即使最坚固细胞壁（如Chlorella）的极端剪切、空化和湍流。HPH据报蛋白回收率为65%–85%，效率随通过次数增加。高速均质、连续模式超声和微流化代表机械破壁的变体，具有不同的能量需求和可放大性特征。机械方法的普遍挑战是操作中产热，需主动冷却以防止提取蛋白热变性。尽管能耗高（大规模运营的关键经济关切），机械方法仍是生产变性最小、高功能性蛋白提取物（适用于食品和制药应用）的首选。
3.5 Thermal-Assisted Extraction
热辅助提取利用高温破坏微藻细胞膜和细胞壁，增加膜流动性和通透性，从而促进蛋白释放到周围介质。采用60–121°C、15 min至2 h的高压灭菌、水浴加热或蒸汽处理。在中等温度（60–80°C）下，主要机制是膜蛋白热变性和细胞壁多糖部分水解，而在更高温度（>100°C）下实现更广泛的破壁和蛋白溶解。蛋白得率通常为40%–60%，低于碱法或机械法，主要因为热处理可同时导致蛋白聚集和不可逆变性，降低可提取蛋白含量。100°C以上蛋白与碳水化合物的美拉德褐变进一步限制热提取蛋白的功能和营养品质。然而，热处理具有同时实现微生物灭活和酶失活的独特优势，提高生物质安全性和货架稳定性，这在处理废水培养微藻时是有益特征。热预处理常与碱法或酶法提取集成为协同步骤，其中中等加热（60–80°C）增加细胞壁通透性，增强后续化学或酶处理的可及性而不造成过度蛋白损伤。
4 Non-Conventional Extraction Technologies
4.1 Ultrasound-Assisted Extraction
UAE利用声空化——高频声波（20–100 kHz）产生微气泡的形成、生长和剧烈坍塌——以显著能效破坏微藻细胞壁。空化气泡坍塌产生强烈局部微射流和冲击波，机械破坏细胞膜并提高传质速率，促进蛋白快速释放到提取介质。UAE操作参数（频率、功率强度200–800 W、脉冲占空比、处理时间5–60 min和温度）关键影响提取得率和蛋白品质。报告蛋白回收值随物种、预处理、操作条件和回收计算而显著变化，所选研究报告约70%–88%。UAE的关键优势是与水性、缓冲液和温和溶剂体系兼容，避免有机溶剂的毒理学关切。UAE还被报告通过部分展开蛋白结构而不广泛变性来改善蛋白溶解度和乳化特性，这对食品配料应用有利。挑战包括高强度下局部过热可能、探头表面侵蚀可能污染提取物，以及大规模反应器中难以实现均匀空化分布。连续流超声系统和双频UAE配置正在积极开发以解决放大局限并提高能效。
4.2 Microwave-Assisted Extraction
MAE应用电磁辐射（300–300,000 MHz，工业频率通常2.45 GHz）加热微藻细胞内极性分子（主要是水），产生快速内部蒸汽压，从内向外破坏细胞壁。这种体积加热机制与常规传导加热根本不同，可实现显著更短的处理时间（1–15 min，对比热法的数小时），并具有更高能效和更低溶剂消耗。300–900 W功率的MAE从Spirulina和Chlorella物种获得65%–82%的蛋白提取率，最高得率使用碱性水性介质（pH 9–11）作为提取溶剂。MAE的短处理时间尤其有利于保留热不稳定生物活性蛋白如藻蓝蛋白，但必须仔细控制功率和持续时间以防止过高温度下蛋白变性。微波反应器中不均匀场分布是公认挑战，可导致局部过热（热点）和样品体积内提取效率不均。现代MAE系统采用旋转平台、多模腔和聚焦微波探头改善均匀性。MAE与酶预处理或超声联合时已显示协同效应，得率超过任何单一方法，使其成为混合提取策略的有效组成部分。
4.3 Enzyme-Assisted Extraction
EAE代表一种高选择性、温和且环境可持续的微藻蛋白回收方法，利用细胞壁降解酶的催化活性破坏蛋白释放的结构障碍。酶的选择取决于目标物种的细胞壁组成：纤维素酶和半纤维素酶用于纤维素壁的Chlorella；溶菌酶用于蓝细菌（Spirulina）肽聚糖层；蛋白酶用于同时蛋白水解和提取。EAE通常在温和温度（37–55°C）和近中性pH（4–8）下进行1–6 h，这些条件在保留蛋白生物活性和功能特性方面远优于酸法或碱法提取。优化单酶和酶混合物处理C. vulgaris和Microchloropsis物种已报告72%–90%的蛋白回收效率。水解度（DH）描述裂解肽键的比例，可精确调控以产生完整蛋白、大多肽或具不同功能或健康促进特性的较小生物活性肽。EAE的主要局限包括食品级酶制剂成本相对较高、相比物理方法处理时间较长、处理后需酶失活以防止过度水解，以及针对每种微藻物种和培养批次的优化需求。固定化酶系统和重组酶的使用是降低成本和提高工艺一致性的有效策略。
4.4 PEF-Assisted Extraction
PEF技术向微藻细胞悬液施加短暂强电脉冲（5–40 kV/cm，10–100 μs持续时间），诱导电穿孔，在细胞膜上形成瞬时或永久纳米孔而不显著升高整体温度。PEF的非热性质是提取热敏蛋白（如藻蓝蛋白和捕光复合物）的关键优势，这些蛋白在PEF处理条件下保留天然结构和发色团完整性。使用优化PEF参数已证明从Spirulina、Microchloropsis和Haematococcus获得68%–85%的蛋白回收，比能量输入50–200 kJ/kg被认为对工业过程经济可行。PEF可在与工业处理量兼容的连续流配置中运行，相对间歇机械方法具有显著优势。挑战包括PEF设备相对常规方法更高的资本成本、对细胞壁特别坚固细胞（如Chlorella）效力有限，以及需要精确脉冲控制以避免过度焦耳加热。固态脉冲功率发生器的近期进展已大幅降低设备成本，PEF日益被视为微藻生物精炼中选择性蛋白提取的关键使能技术。
4.5 High-Pressure Processing
HPP将微藻生物质置于100–600 MPa等静压下，通常在近环境温度，通过压缩诱导的机械失效和分子间作用力失稳引起细胞膜和细胞壁的不可逆破坏。与HPH（涉及剪切和空化）不同，HPP依据帕斯卡原理在整个样品体积施加均匀压力，确保均匀处理并最小化产热。HPP已应用于湿微藻糊和细胞悬液，在300–600 MPa下对Microchloropsis和Chlorella物种实现70%–87%的蛋白回收。HPP的非热特性尤其受重视，用于提取结构完整、功能活跃的蛋白级分，研究显示HPP提取蛋白相对热提取对应物具有更优的乳化和凝胶特性。HPP作为食品加工技术已确立（已商业部署用于果汁巴氏杀菌和即食餐安全处理），这便于食品级微藻蛋白生产的法规接受。局限包括多数商业HPP系统的间歇操作模式（相比连续方法限制通量）、高设备购置和维护成本，以及对硅化壁细胞（硅藻）效力降低。连续HPP系统和HPP-酶联合方法正在开发以解决通量和效率约束。
4.6 Subcritical Water Extraction
SWE，亦称加压热水提取，利用液态水在其大气沸点（100°C）以上但临界温度（374°C）以下、在升压（1–50 bar）下保持时的独特物理化学性质。在这些亚临界条件下，水的介电常数显著降低，接近极性有机溶剂的值，同时其表面张力、粘度和氢键能力同时降低，共同增强对广泛生物分子的溶剂化能力和传质。对于微藻蛋白提取，已报告100–200°C、5–60 min、10–50 bar下实现60%–80%的蛋白回收，优势是以水为唯一溶剂，消除有机溶剂关切。SWE介导蛋白释放的机制涉及细胞壁多糖部分水解、膜脂溶解和蛋白部分水解为冷却后仍留在溶液中的肽。这种部分水解可被利用来同时提取具抗氧化、抗高血压或免疫调节活性的生物活性肽。主要局限包括150°C以上氨基酸降解（尤其赖氨酸和蛋氨酸）风险、影响色泽和风味的潜在美拉德反应产物，以及需要专用耐压设备。因此，温度优化对于在SWE应用中平衡蛋白得率与品质保持至关重要。
5 Novel and Advanced Extraction Technologies
5.1 DES-Based Extraction
DES是一类由氢键供体（HBD）和氢键受体（HBA）以特定摩尔比混合形成的设计溶剂，产生熔点显著低于任一纯组分的共熔混合物。用于微藻蛋白提取的最广泛研究的DES体系包括氯化胆碱（HBA）与HBD（如尿素、甘油、乙二醇、乳酸或苹果酸）配对。天然深共熔溶剂（NADES）完全由天然存在的化合物（如有机酸、糖和氨基酸）组成，因其推定的生物相容性和可生物降解性，对食品和制药应用尤具意义。DES提取通过多种机制运作：破坏细胞壁氢键、溶解膜脂以及通过静电和氢键相互作用直接溶剂化蛋白分子。已证明使用优化DES体系在40–80°C下从Spirulina和Chlorella获得78%–93%的蛋白回收，选择性可通过改变HBD:HBA比例和含水量调控。DES的主要优势是极低蒸气压和不燃性，相对有机溶剂体系改善工艺安全。挑战包括DES粘度升高（降低传质速率，需用水或共溶剂稀释）以及针对特定目标分子的溶剂组成复杂优化。通过蒸发或膜过滤回收DES可行但增加工艺复杂性和能源成本。
将DES归类为固有“绿色”需要限定。低蒸气压和不燃性相对常规有机溶剂减少特定工艺安全和挥发性排放关切，但其本身并不确立有利的毒理学或生命周期特征：许多氯化胆碱基DES组分尚未经过全面的食品接触毒理学评价，不完全回收后蛋白级分中残留DES污染对食品级应用而言表征不足，且尚无DES体系获得明确法规许可（如欧洲食品安全局[EFSA]新食品或FDA一般公认安全[GRAS]地位）专门用于微藻蛋白提取。DES生产（尤其非天然HBD/受体）以及上述能源密集型回收步骤的生命周期影响在所引文献中尚未全面量化。由食品来源组分组成的NADES更可能符合绿色化学原则，但这仍是基于前体来源的推定而非已证明的毒理学或生命周期结果。
5.2 IL-Assisted Extraction
ILs是熔点低于100°C（常在室温或接近室温）的熔盐，由有机阳离子（最常见咪唑鎓、吡啶鎓或季铵离子）与无机或有机阴离子配对组成。其非凡溶剂化性质源于离子、范德华、氢键和π–π堆积相互作用的独特组合，能够溶解包括蛋白、纤维素和甲壳素在内的对常规溶剂顽固的生物聚合物。对于微藻蛋白提取，IL-水两相体系（IL-ATPS）已成为特别有效的平台，其中蛋白在IL富集上相和盐富集下相之间的选择性分配使单步同时提取和纯化成为可能。使用咪唑鎓基ILs从Spirulina提取藻蓝蛋白和从Chlorella提取总可溶性蛋白已实现75%–91%的蛋白回收和超过80%的纯度。ILs可通过选择阳离子/阴离子组合在疏水性、粘度和溶剂化能力方面精细调控，提供前所未有的选择性控制。工业采用的主要障碍包括任务特异性ILs的高合成成本、许多第一代ILs（尤其咪唑鎓基）的环境和毒理学关切，以及从富蛋白提取物中回收和再循环IL的复杂性。胆碱基ILs和氨基酸衍生ILs代表目前正在研究的更可持续选项的新一代生物相容、可生物降解替代品。
同样，仅凭可忽略挥发性将ILs描述为低溶剂，在考虑毒性、回收和法规地位后并不充分。第一代咪唑鎓基ILs仍是微藻蛋白提取研究最广泛的类别，具有已记录的环境和毒理学关切，且所引文献尚未证明在食品级纯度阈值下完全去除蛋白级分中的残留IL。迄今为止尚无IL基提取工艺获得微藻蛋白的新食品或GRAS法规许可。胆碱基和氨基酸衍生ILs原则上代表更生物相容的替代品，但支持其相对常规提取具有真正可持续性优势的全面生命周期和残留污染数据仍有限。
5.3 Supercritical Fluid Extraction
SFE采用高于其临界温度和压力的流体，最常见超临界CO2（sc-CO2：Tc = 31.1°C，Pc = 7.38 MPa），其具有类气体扩散性和类液体溶剂化能力，能够从复杂基质中高效选择性提取生物分子。纯sc-CO2的SFE主要应用是从微藻中提取脂质和色素，因为非极性sc-CO2优先溶解非极性化合物；然而，添加极性共溶剂（改性剂）如乙醇（5%–20%）大幅扩展sc-CO2对半极性和极性蛋白的溶剂化能力。改性sc-CO2体系的微藻蛋白SFE回收率为60%–80%，额外优势是减压后产生无溶剂提取物，因为CO2直接蒸发，在蛋白级分中不留残留，这对食品应用是重大法规优势。SFE参数（压力、温度、共溶剂浓度、流速）的可调性允许在顺序提取步骤中分级不同生物分子类别，符合总生物质价值化的生物精炼目标。局限包括sc-CO2主要非极性选择性限制直接蛋白提取、耐压设备的高资本投入、间歇操作约束以及相对水性提取方法通量较低。SFE最有效部署为预提取步骤，去除脂质和色素，产生脱脂、富蛋白残渣供后续高效水性提取。
5.4 Membrane-Based Separation Technologies
膜分离技术为初始提取后微藻来源蛋白的浓缩、纯化和分级提供强大、可放大且节能的平台。截留分子量（MWCO）为10–100 kDa的超滤（UF）膜最广泛用于蛋白浓缩，有效截留蛋白同时允许水、盐和小有机分子通过。纳滤（NF）和反渗透（RO）膜可浓缩较小肽并去除残留溶剂或盐。渗滤（一种连续缓冲液交换UF模式）用于脱盐和纯化蛋白浓缩物至食品级或制药应用所需水平。错流（切向流）过滤配置因显著降低膜污染率和连续操作能力而在工业上优于死端过滤。使用优化UF方案对Spirulina藻蓝蛋白、Chlorella总蛋白和Microchloropsis水溶性蛋白可实现80%–95%的蛋白回收率和高纯度（>85%蛋白DW）。挑战包括多糖、脂质碎片和细胞碎片造成的膜污染降低通量并需频繁就地清洗（CIP）方案，增加运营成本和停机时间。陶瓷膜因化学耐受性、可蒸汽灭菌性和在苛刻清洗条件下的耐久性而日益受青睐。将膜分离集成到初始破壁和初级提取后的多级微藻生物精炼级联中，是实现食品配料和制药市场所需蛋白纯度和功能性的关键策略。
5.5 Nanotechnology-Assisted Extraction
纳米技术辅助提取代表新兴创新前沿，应用纳米级材料增强微藻蛋白提取的效率、选择性和可持续性。磁性纳米颗粒（MNPs），特别是用蛋白结合配体或离子基团功能化的氧化铁（Fe3O4）纳米颗粒，已证明能够从复杂微藻提取物中靶向捕获和快速磁分离特定蛋白，回收效率为75%–90%。金属氧化物纳米颗粒（ZnO、TiO2）具光催化活性，已被探索作为破壁剂，在光激活下产生活性氧（ROS）氧化降解细胞壁，促进蛋白释放。碳基纳米材料，包括氧化石墨烯（GO）和碳纳米管（CNTs），已被研究作为从稀提取物中选择性分离蛋白的纳米吸附剂。使用生物聚合物纳米颗粒（壳聚糖、海藻酸盐和玉米醇溶蛋白）对提取蛋白进行纳米包封可增强蛋白在储存和加工中的稳定性，并在制药背景下实现靶向递送。纳米乳化和纳米分散技术改善微藻蛋白配料在食品配方中的生物利用度和功能性能。食品级应用的关键关切包括金属和碳纳米材料的潜在细胞毒性、食品接触纳米材料的法规批准地位，以及纳米材料合成和回收的复杂性与成本。
应强调，上述纳米技术辅助方法，包括MNP捕获、光催化金属氧化物介导破壁、碳基纳米吸附剂和纳米包封，在所引文献中均仅在实验室规模使用台式反应体积得到证明；这些研究均未报告中试规模验证，本综述亦未鉴定出纳米技术辅助微藻蛋白提取的商业食品级应用。这一区分很重要，因为报告的回收效率（75%–90%）是在受控实验室条件下获得的，尚未证明可转化为中试或工业通量。纳米颗粒残留的食品安全评价（包括潜在纳米颗粒迁移到最终蛋白产品中、摄入纳米材料的胃肠归趋和吸收，以及目前缺乏经过验证的蛋白配料中痕量纳米颗粒检测分析方法）是未来该技术在食品应用中任何规模化的前提而非并行考量。主要司法管辖区的纳米食品配料法规框架仍在制定中，全面安全评价是商业部署的前提。
5.6 Integrated Biorefinery Approaches
微藻蛋白生产的集成生物精炼概念旨在通过策略性排序、工艺兼容的提取步骤，最大化从生物质每个组分（蛋白、脂质、碳水化合物、色素和矿物质）中提取的价值，共同实现近零废弃物利用。在典型生物精炼级联中，温和初始步骤（如PEF或低强度UAE）选择性释放水溶性蛋白和色素，随后中等机械破壁（珠磨或HPH）释放剩余胞内蛋白，废生物质随后进行脂质提取（SFE或溶剂）和碳水化合物水解用于沼气或发酵原料。集成生物精炼配置可通过顺序回收蛋白、脂质、色素、碳水化合物和其他有价值级分，大幅改善总生物质价值化。技术经济分析表明，多增值产品联产相对单产品提取可改善微藻加工的经济表现，尽管收益幅度强烈取决于生物质组成、工艺配置、产品得率和市场价值。关键设计考量包括确保上游提取步骤不使预期用于食品或制药的蛋白变性或污染、选择与后续加工阶段兼容的顺序溶剂和条件，以及设计维持各联产品市场品质的分级顺序。微藻生物精炼的生命周期和可持续性评价一致表明，相对常规农业蛋白源，每kg蛋白的温室气体排放、用水和土地占用更低，强化了该生产范式的环境合理性。
5.7 Artificial Intelligence and Process Optimization Techniques
人工智能（AI）和机器学习（ML）方法日益整合到微藻蛋白提取研究与工艺开发中，解决多变量提取体系的固有复杂性，这些体系难以通过常规单因素（OFAT）甚至响应面方法（RSM）优化。人工神经网络（ANN）、支持向量机（SVM）、随机森林和深度神经网络（DNN）已在实验数据集上训练，以开发将提取参数（pH、温度、时间、酶浓度、超声功率等）与蛋白得率、纯度和功能特性关联的预测模型。RSM仍广泛用于系统提取优化，但其多项式模型假设限制了预测准确性。
