基于纳米孔测序的无精子症染色体平衡易位患者断点定位与中断基因鉴定

《JOURNAL OF CLINICAL LABORATORY ANALYSIS》：Breakpoint Mapping and Disrupted Gene Identification in Azoospermic Patients With Chromosomal Balanced Translocation by Nanopore Sequencing

目的：评估纳米孔长读长测序技术在无精子症伴染色体平衡易位患者中进行精确断点定位的应用价值，并阐明易位诱导精子发生失败的分子机制。 方法：采集两例伴有染色体平衡易位的无精子症患者外周血标本。以G显带核型分析和染色体微阵列分析结果为参照标准，在PromethION平台上对外周血样本进行全基因组长读长测序。利用Integrative Genomics Viewer可视化断点位置，并通过UCSC Genome Browser进行基因注释。 结果：两个样本均成功完成测序，平均读长分别为9713.3 bp和8129.8 bp。相较于传统细胞遗传学方法，纳米孔测序提供了更优的染色体畸变分子分辨率。通过IGV可视化共鉴定出8个断点，其中4个达到单碱基分辨率精确定位。注释结果显示，5个断点位于基因间区且未破坏基因完整性，而3个断点分别位于AFF2、MAGI1和FTO基因的内含子区域内，导致这些基因发生中断。 结论：本研究利用纳米孔长读长测序技术对两例无精子症患者的染色体断点进行了精确定位，包括常规核型分析无法检测的隐匿性断点。三个断点处AFF2、MAGI1和FTO基因的中断为易位相关精子发生失败提供了新的候选基因证据，证实了纳米孔测序作为结构变异表征和精子发生相关基因发现的有力工具。

论文解读：基于纳米孔测序的无精子症染色体平衡易位患者断点定位与中断基因鉴定

一、研究背景与科学问题

非梗阻性无精子症占男性不育病例的10%–15%，染色体结构异常是其重要遗传病因。染色体平衡易位是最常见的结构异常类型，约5.9%–16.1%的男性携带者表现为无精子症或严重少弱精子症。传统观点认为，平衡易位导致的不育主要由减数分裂过程中产生不平衡配子所致。然而，近年研究发现易位可通过“断点–基因中断–精子发生障碍”的新致病机制发挥作用，例如Schilit等发现SYCP2基因因易位介导的增强子捕获而上调3.2倍，破坏了联会复合体结构并导致严重少精子症。因此，精确定位平衡易位的断点对于理解其致病机制至关重要。

现有检测技术存在明显局限：G显带核型分析虽被视为染色体结构重排检测的“金标准”，但其分辨率有限（5–10 Mb），无法精确定位断点；荧光原位杂交依赖特异性探针且技术复杂；二代测序读长短（150–300 bp），难以跨越重复区域并准确定位断点。纳米孔测序技术无需PCR扩增即可提供超长读长（可达数百千碱基）、实时测序和对复杂基因组区域的均匀覆盖，能够实现单碱基分辨率的断点定位并同时检测微缺失和微重复，还可利用天然长读长中的SNP信息进行单倍型分型，为胚胎植入前遗传学检测提供重要标记。

二、研究设计与主要结论

研究人员收集了两例诊断为非梗阻性无精子症伴染色体平衡易位的患者外周血样本，来自厦门市妇幼保健院生殖医学科，经伦理委员会批准并获得知情同意。通过纳米孔长读长测序进行全基因组分析，成功鉴定了8个染色体断点，其中4个达到单碱基分辨率，2个在5 bp以内。注释发现3个断点分别位于AFF2、MAGI1和FTO基因的内含子区域导致基因中断，为易位相关精子发生失败提供了新的候选基因证据。研究表明纳米孔测序是结构变异表征和精子发生相关基因发现的有力工具，为临床遗传咨询提供了关键的分子证据。

三、关键技术方法

1. 1.
   样本来源：厦门市妇幼保健院生殖医学科两例非梗阻性无精子症伴染色体平衡易位患者的外周血样本。
2. 2.
   纳米孔测序：采用PromethION平台进行全基因组长读长测序，使用Ligation Sequencing Kit构建文库，R9.4 Spot-On Flow Cell上机运行约48小时。
3. 3.
   生物信息学分析：使用Guppy v6.3.0进行碱基识别转换为FASTQ格式；minimap2 v2.24比对至GRCh37/hg19参考基因组；Sniffles2 v2.0.7检测结构变异；dnarrange v1.5.3分析染色体重排；IGV手动验证断点位置；UCSC Genome Browser进行基因注释。

四、研究结果

3.1 患者临床数据：病例1为32岁男性，正常表型和智力发育，原发不育9年，精液分析示无精子症，G显带核型为46,Y,t(X;5)(q28;p15.1)，SNP-array和Y染色体AZF微缺失检测阴性。病例2为29岁男性，正常表型和智力发育，原发不育2.5年，精液分析示无精子症，核型为涉及3号、5号和16号染色体的复杂重排，SNP-array和AZF检测阴性。

3.2 纳米孔测序数据质控：病例1和病例2的平均读长分别为9713.3 bp和8129.8 bp，基因组覆盖率分别为92.22%和92.24%，平均深度分别为16.69×和14.26×。

3.3 染色体易位断点的基因组定位：共鉴定8个染色体断点，均位于基因组唯一序列区域且有超过5条reads跨越断点。病例1的两个断点与核型分析一致：X染色体断点位于Xq28（ChrX:147,998,514–147,998,515），5号染色体断点从5p15.1精细定位至5p14.3（Chr5:19,367,038–19,367,039）。病例2为涉及三条染色体的复杂染色体重排，核型分析识别5个断点，而纳米孔测序揭示6个断点，其中3号染色体形成4个片段，且发现5q14.3→5q33.3片段为反向插入，形成了比核型分析更复杂的衍生染色体结构。8个断点中4个达到单碱基分辨率，2个在5 bp内，最大间隔为5717 bp。

3.4 断点处中断基因分析：8个断点中5个位于基因间区未破坏基因完整性，3个断点导致基因中断：病例1中ChrX:147,998,514–147,998,515断点位于AFF2基因内含子8；病例2中Chr3:65,894,036–65,899,651断点位于MAGI1基因内含子1，Chr16:53,815,988–53,815,992断点位于FTO基因内含子1。

五、讨论与结论总结

讨论部分：本研究利用纳米孔长读长测序成功鉴定了8个断点，与既往报道一致，证实纳米孔测序可在低覆盖度下实现精确断点定位。病例2的复杂染色体重排中，纳米孔测序揭示了核型分析未能识别的额外断点和更复杂的重组模式，包括反向插入片段，凸显了长读长测序在检测人类结构变异方面的优势。关于三个中断基因：AFF2编码核转录激活因子，属于AF4/FMR2家族和超级延伸复合体组分，参与可变剪接调控。虽然AFF2与FRAXE型X连锁智力障碍相关，但病例1的断点位于内含子8而非启动子近端重复区域，机制不同；且患者因男性不育就诊，智力评估未系统进行。Escamilla等在2354例不育男性中发现AFF2变异显著富集，但支持其在严重精子发生障碍中作用的证据仍有限。MAGI1编码膜相关鸟苷酸激酶支架蛋白，属于MAGUK家族，主要功能于神经元突触和上皮紧密连接。MAGUK蛋白对血睾屏障的组装和维持至关重要，而血睾屏障由相邻支持细胞建立，为减数分裂和减数分裂后生殖细胞发育提供必需微环境，其破坏会导致精子发生停滞和不育。Human Protein Atlas数据显示MAGI1在支持细胞和间质细胞中表达增强。断点破坏MAGI1可能损害血睾屏障完整性，影响生殖细胞分化所需微环境。FTO编码α-酮戊二酸依赖性双加氧酶，作为mRNA N⁶-甲基腺苷去甲基化酶发挥作用。Sui等综述了m⁶A修饰在男性生育中的作用，指出FTO遗传变异与精液质量下降相关。Wu等在不育男性中发现两种FTO功能丧失突变，产生截短FTO蛋白并升高m⁶A修饰水平，证实FTO缺乏与男性不育的关联，并证明FTO通过m⁶A依赖机制调节雄激素受体翻译，影响间质细胞成熟和精原细胞增殖。断点破坏FTO可能扰乱精子发生所需的m⁶A稳态，通过雄激素信号和生殖细胞维持受损导致无精子症。本研究的两项创新：一是通过纳米孔长读长测序实现单碱基分辨率断点定位并识别隐匿性断点，包括复杂染色体重排中的反向插入片段；二是发现三个断点直接中断AFF2、MAGI1和FTO等精子发生关键基因，为“断点–基因中断–精子发生障碍”分子机制提供了新候选基因证据。局限性包括：因剩余样本不足和患者失访未能进行断点跨越PCR和Sanger测序正交验证；未进行功能研究验证基因中断的生物学后果；基因中断与无精子症表型的因果关系尚未确立，需CRISPR编辑和体外精子发生模型进一步研究。

结论翻译：总之，纳米孔测序是对伴有染色体平衡易位的无精子症患者进行染色体断点精确描绘和基因中断分析的有力工具。本研究不仅提高了染色体异常的分子表征准确性，还鉴定了包括AFF2、MAGI1和FTO在内的中断基因，从而为复杂染色体重排相关的精子发生失败病因学提供了新的候选基因见解。此外，这些发现为生殖遗传结构重排的高分辨率表征提供了可复制的策略，并为临床遗传咨询提供了关键的分子证据。