2-羧基-2-庚基-吲哚啉-3-酮（IDC）对HeLa细胞三维球体的细胞毒性及促凋亡效应研究

《JOURNAL OF APPLIED TOXICOLOGY》：Cytotoxic and Pro-Apoptotic Effects of the Compound 2-Carboxy-2-Heptano-Indolin-3-One in HeLa Cell Spheroids

吲哚啉酮类化合物（indolinones）是具有公认抗肿瘤特性的化合物，可作为多种激酶的抑制剂。然而，2-羧基-2-庚基-吲哚啉-3-酮（2-carboxy-2-heptano-indolin-3-one，IDC）在宫颈癌模型中的抗肿瘤效应尚未被研究。本研究探讨了IDC对HeLa细胞的细胞毒性及促凋亡效应，重点采用三维球体（spheroid）模型，并评估其对球体生长、细胞周期分布、细胞凋亡以及与细胞死亡和DNA损伤应答相关基因表达的影响。采用刃天青（resazurin）法在单层培养中评估细胞活力，通过显微镜检查和体积分析评估球体生长和形态。通过流式细胞术研究细胞凋亡和细胞周期分布，通过RT-qPCR评估基因表达。IDC使单层培养中的细胞活力降低达80%，并显著抑制球体生长，伴有结构完整性丧失且撤药后无恢复。流式细胞术显示，IDC处理后凋亡细胞占81.7%–83.6%，而溶剂对照组为35.8%。未观察到G1、S或G2/M期细胞周期分布的显著变化。RT-qPCR显示CASP8、CASP9、CASP3、BBC3和GADD45A的mRNA水平升高，TP53、CDKN1A和MYC水平降低。这些转录变化提示凋亡信号传导和DNA损伤应答机制的参与。总体而言，IDC在HeLa细胞中表现出细胞毒性和促凋亡效应，并损害三维球体的生长和完整性，支持进一步研究其在宫颈癌中的抗肿瘤潜力。

宫颈癌（cervical cancer）在全球女性死亡率中位居前列，2022年为第四大常见癌症类型，估计新增66万例、死亡35万例。尽管肿瘤治疗取得进展，但肿瘤进展和治疗耐药背后的许多分子机制仍知之甚少。在此背景下，鉴定和评估具有潜在抗肿瘤活性的新型生物活性化合物仍是重要的研究方向。HeLa细胞系来源于人宫颈腺癌，已被表征并作为筛选新型抗癌剂的成熟体外模型。然而迄今尚无研究评估2-羧基-2-庚基-吲哚啉-3-酮在宫颈癌模型中的抗肿瘤潜力。目前宫颈癌的常规治疗（如紫杉醇、顺铂、氟尿嘧啶、环磷酰胺、拓扑替康和贝伐珠单抗）虽然有效，但常引起严重副作用，如破坏健康细胞和耐药，促进肿瘤复发和转移。因此，理解新化合物诱导特异性有效细胞死亡的分子机制至关重要。在有望的化合物中，从铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，LV株）分离的2-羧基-2-庚基-吲哚啉-3-酮（IDC）引人注目。该化合物属于吲哚啉酮家族，以抗增殖和促凋亡特性著称，具有作用于多条肿瘤信号通路的潜力。吲哚啉酮可抑制受体酪氨酸激酶（如MET、VEGFR、FGFR、PDGFR和c-Kit）以及细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases）。这些分子最相关的作用机制之一是诱导细胞凋亡（apoptosis），这是组织稳态的基础过程，也是抗肿瘤应答的关键组成部分。细胞凋亡可通过外源性通路（由死亡受体介导，最终激活caspase-8）或内源性通路（由基因毒性应激和线粒体释放细胞色素c触发，导致caspase-9激活）发生，两条通路均导致效应caspase-3的激活。内源性通路受Bcl-2家族蛋白调控，其中促凋亡基因BBC3（PUMA）作为研究靶点突出。原癌基因MYC是增殖和代谢的主要调节因子之一，在多种癌症中频繁过表达。尽管取得进展，传统二维模型仍存在许多局限性，不能忠实再现肿瘤微环境的结构和生化复杂性。在此背景下，三维模型（如球体）代表了更现实的方法。鉴于此，本研究旨在评估从铜绿假单胞菌LV菌株分离的化合物2-羧基-2-庚基-吲哚啉-3-酮的细胞毒性能力（2D系统）及其在HeLa细胞系球体（3D）中的抗增殖、诱导凋亡和基因表达调节效应。

研究人员开展的研究得出以下结论：IDC显著降低HeLa细胞活力，抑制三维球体生长并损害撤药后的恢复能力；IDC诱导凋亡性细胞死亡，伴随CASP8、CASP9、CASP3、BBC3和GADD45A mRNA表达升高，TP53、CDKN1A和MYC mRNA水平显著降低。这些发现支持IDC在宫颈癌细胞中的抗肿瘤潜力，为后续阐明其分子机制及在更复杂临床前模型中的评估提供了基础。

主要关键技术方法：研究采用人宫颈腺癌细胞系HeLa（来自里约热内卢细胞库），以刃天青还原法评估单层培养细胞活力；采用液滴覆盖法在琼脂糖表面形成三维球体，通过显微镜成像结合AnaSP和ReViSP软件进行形态和体积分析；通过流式细胞术（Annexin V/7-AAD染色）检测凋亡，以碘化丙啶（PI）染色分析细胞周期；采用RT-qPCR（以RPL0为内参基因，2^?ΔΔCT法）评估基因表达。IDC浓度设为100、150和200 μM（基于IC₅₀约156.4 μM），多柔比星（8 μM）为阳性对照，DMSO为溶剂对照。

研究结果：（1）IDC的细胞毒性：通过刃天青法在单层培养中得出，IDC在100、150和200 μM浓度下分别使细胞活力降低约14%、37%和80%，显示浓度依赖性细胞毒性效应。（2）球体生长与形态：通过显微镜成像和体积分析得出，对照球体维持紧凑规整的三维结构，而IDC处理球体呈现进行性结构破坏，所有测试浓度均抑制球体生长；撤药后IDC处理球体细胞保持分散，未恢复原始球体结构，提示IDC对球体完整性具有持续效应。（3）凋亡性细胞死亡：通过Annexin V/7-AAD流式细胞术得出，IDC处理后活细胞比例从对照的49.4%降至15.0%–16.4%，总凋亡率从对照的35.8%升至81.7%–83.6%，坏死细胞比例从14.8%降至1.4%–1.9%。（4）细胞周期分布：通过流式细胞术DNA含量分析得出，IDC处理后G1期比例轻度降低、S期轻度升高，但各实验组间无统计学显著差异。（5）基因表达分析：通过RT-qPCR得出，IDC（150 μM，24 h）使CASP8、CASP9和CASP3 mRNA分别升高2.36倍、9.09倍和6.14倍，BBC3升高2.00倍，GADD45A升高5.27倍；TP53和CDKN1A分别降至0.31倍和0.49倍，MYC降至0.49倍；BCL2、NFKB、BECN1、MTOR和SQSTM1无显著变化。

讨论部分总结：研究人员讨论指出，IDC降低HeLa细胞活力、抑制三维球体生长并损害撤药后恢复，同时诱导凋亡性细胞死亡。CASP8、CASP9和CASP3 mRNA升高提示外源性和内源性凋亡信号传导相关基因的参与；BBC3和GADD45A升高分别与促凋亡信号和细胞应激应答相关；TP53、CDKN1A和MYC降低与既往在HepG2细胞中的报道一致。研究人员指出，GADD45A和BBC3的同时升高提示可能存在p53非依赖性调控，但相关信号通路未经直接研究。BBC3编码的PUMA可拮抗抗凋亡BCL-2家族蛋白、促进线粒体外膜通透化，但PUMA蛋白水平、线粒体膜通透化、细胞色素c释放和caspase活性均未直接评估，故不能从现有数据确立该机制的功能性参与。CDKN1A降低与CASP3升高同时发生，但二者直接关系无法确立；24 h时点未见细胞周期分布显著变化，不排除更晚时间点的延迟效应。MYC降低可能部分解释球体生长减少。研究局限性包括：未评估蛋白表达和功能水平、未直接评估基因毒性、缺乏非肿瘤细胞模型以评估选择性。结论部分翻译：总之，IDC在HeLa细胞中表现出细胞毒性和促凋亡效应，并损害三维球体的生长和结构完整性。这些效应伴随涉及凋亡信号传导和细胞应激应答相关基因的转录变化。尽管本研究未确立特定分子通路的功能性激活，但支持IDC在宫颈癌细胞中的抗肿瘤潜力，为进一步研究其分子机制及在更复杂临床前模型中的评估提供了基础。