《Neurotherapeutics》：Reperfusion enhances treg-mediated neuroprotection and IL-10 signaling in a mouse model of large vessel occlusion
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缺血性卒中急性再灌注治疗的适应证近期已扩大至包括大面积缺血核心患者，凸显了对能够最大化组织挽救的靶向神经治疗药物的迫切需求。临床前研究表明，即使在广泛缺血性损伤后，早期再灌注也能减轻梗死扩展并激活内源性再生通路，尽管驱动这些治疗益处的精确机制仍未完全阐明。本研
缺血性卒中急性再灌注治疗的适应证近期已扩大至包括大面积缺血核心患者，凸显了对能够最大化组织挽救的靶向神经治疗药物的迫切需求。临床前研究表明，即使在广泛缺血性损伤后，早期再灌注也能减轻梗死扩展并激活内源性再生通路，尽管驱动这些治疗益处的精确机制仍未完全阐明。本研究中，研究人员调查了成功再灌注背后的细胞和分子机制，以寻找免疫治疗的新途径。利用短暂（t-MCAO）和永久（p-MCAO）大脑中动脉闭塞小鼠模型，研究人员全面分析了中枢和外周免疫细胞动力学。分析结果显示，与非再灌注对照组相比，成功再灌注显著提高了调节性T细胞（Treg）比例。在各实验组中，较高的白细胞介素-10（IL-10）水平通常伴随更高的Treg丰度和更好的运动表现。在再灌注的确切时间点进行靶向动脉内递送IL-10直接减轻了脑损伤并改善了神经学结局。这些发现表明，再灌注后放大抗炎信号可能提供神经保护，使动脉内IL-10成为增强机械取栓疗效的潜在辅助神经治疗策略。
缺血性卒中是全球致死率最高的疾病之一。再灌注治疗，包括静脉溶栓和机械取栓（mechanical thrombectomy, MT），已成为主要治疗手段，且治疗时间窗不断扩大。基于影像学显示缺血核心与半暗带不匹配，部分患者可在症状出现后24小时内接受MT。然而，缺乏不匹配证据的患者以往被排除在再灌注治疗之外，因为其脑组织被认为已发生不可逆梗死。近期随机临床试验（如LASTE、RESCUE-Japan LIMIT）表明，对于急性前循环大血管闭塞且存在大面积缺血核心（阿尔伯塔卒中计划早期CT评分[Alberta Stroke Program Early CT Score, ASPECTS]≤5）的患者，MT仍然有效。临床前研究也提示，在广泛缺血损伤后早期再灌注可缩小梗死体积并促进神经和血管再生，但机制尚不完全清楚。因此，阐明再灌注介导组织保护的细胞和分子机制，对于开发靶向免疫治疗具有重要意义。
本研究利用短暂（transient middle cerebral artery occlusion, t-MCAO）和永久（permanent middle cerebral artery occlusion, p-MCAO）小鼠大血管闭塞模型，系统比较了再灌注与非再灌注条件下的免疫细胞动态。结果发现，成功再灌注显著提高了调节性T细胞（regulatory T cell, Treg）比例，而白细胞介素-10（interleukin-10, IL-10）水平与Treg丰度及运动功能呈正相关。在再灌注时经动脉内靶向给予IL-10可直接减轻脑损伤并改善神经功能。这些发现提示，再灌注后增强抗炎信号可能提供神经保护，动脉内IL-10可作为机械取栓后的辅助神经治疗策略。
在技术方法上，研究人员使用来自Jackson Laboratory的成年C57BL/6小鼠，构建了2、4、6小时t-MCAO和p-MCAO模型，并设假手术对照。采用激光散斑血流仪（LSF）监测脑血流，2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色评估梗死体积；流式细胞术分析脑和外周血中Treg（CD4
+CD25
+FOXP3
+）和中性粒细胞（CD11b
+Ly6G
+）亚群；免疫组化检测脑内CD4
+细胞分布；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IL-10浓度；转棒和足错步实验评价运动功能。另在6小时t-MCAO模型中，分别经腹腔（2.5 μg）或动脉内（1 ng）给予His标签IL-10，并使用抗Ly6G抗体（1A8）进行中性粒细胞耗竭。所有动物实验均经Cooper University IACUC批准。
研究结果如下：
（1）MCAO模型的特征：LSF确认所有MCAO模型在缺血期脑血流较基线降低≥70%，t-MCAO再灌注后恢复≥80%；TTC染色显示各组梗死体积无显著差异，表明各模型具有可比性。
（2）MCA闭塞持续时间塑造脑内CD4
+ T细胞分布：免疫组化显示2小时t-MCAO组CD4
+细胞数量最多，随着闭塞时间延长而逐渐减少，p-MCAO组最少；阳性细胞主要位于缺血周围区，而非缺血核心。
（3）MCAO后Treg的闭塞时间依赖性减少和中性粒细胞增加：流式细胞术显示，t-MCAO组脑内Treg比例均显著高于假手术组，其中2小时t-MCAO最高；外周血中2小时和4小时t-MCAO的Treg比例显著高于p-MCAO。相反，脑和血中的中性粒细胞在p-MCAO组最多，且6小时t-MCAO高于其他t-MCAO组。这些结果提示，再灌注发生越早，Treg越多而中性粒细胞越少。
（4）MCAO后IL-10水平的变化：ELISA显示2小时t-MCAO脑内IL-10浓度显著高于p-MCAO；外周血中2小时和4小时t-MCAO显著高于6小时t-MCAO和p-MCAO。6小时t-MCAO与p-MCAO无显著差异，提示长时间闭塞后再灌注组的循环IL-10水平与永久缺血组相似。
（5）t-MCAO和p-MCAO的运动行为学测试：转棒和足错步实验显示，术后第3天（POD3），2小时和4小时t-MCAO组的运动表现优于p-MCAO组，且6小时t-MCAO组比2小时和4小时组更差。说明缺血持续时间和是否再灌注共同影响运动功能恢复。
（6）长期t-MCAO中IL-10给药减轻神经炎症、缺血进展和行为缺陷：在6小时t-MCAO模型中，动脉内（IA）给药后脑内His-tag阳性细胞最多，随后依次为腹腔（IP）给药和安慰剂组；IA组Treg比例、IL-10水平显著高于IP和安慰剂组，中性粒细胞则显著降低；IA组梗死体积显著小于其他组；行为学上，IA组转棒潜伏期更长、足错步更少。表明IL-10给药可抑制神经炎症并减小梗死体积，动脉内途径更为有效。
（7）中性粒细胞耗竭增强严重缺血后IL-10的保护效应：在6小时t-MCAO模型中，抗Ly6G耗竭中性粒细胞后，脑和血中性粒细胞显著减少；耗竭组梗死体积较安慰剂减小，而抗Ly6G联合IL-10组梗死体积最小。行为学上，耗竭组及联合组在POD1-3表现出较少的足错步和较长的转棒潜伏期，联合组效果最佳。说明中性粒细胞耗竭与IL-10治疗具有协同作用。
讨论部分指出，t-MCAO模型相比p-MCAO更好的神经恢复可能与Treg介导的抗炎增强和中性粒细胞介导的神经毒性降低有关。虽然再灌注传统上被认为是中性粒细胞浸润的前提，本研究发现永久缺血也可诱导明显的中性粒细胞聚集。IL-10不仅抑制中性粒细胞浸润，还可能通过促进Treg扩增和诱导小胶质细胞向抗炎表型极化发挥保护作用。中性粒细胞耗竭联合IL-10效果更佳，提示IL-10还存在不依赖中性粒细胞的其他机制。本研究首次在长时间闭塞的t-MCAO模型中分析Treg动态，并首次报道动脉内IL-10给药在缺血性卒中模型中的应用。局限性包括观察期仅3天、腹腔和动脉内剂量不同（2.5 μg vs 1 ng），以及未测量血糖水平。
综上所述，本研究得出结论：长期t-MCAO后的再灌注增加了Treg比例和IL-10水平，与p-MCAO永久缺血相比产生更强的神经保护和运动功能改善。IL-10补充实验显示，在所测剂量下，动脉内给药比腹腔给药更有效地抑制神经炎症、减小梗死体积，并增强Treg活性和内源性IL-10产生。这些发现提示，再灌注后支持抗炎反应可能促进缺血性卒中神经保护，动脉内IL-10给药作为血栓切除术后的辅助治疗具有临床应用潜力。
