《Journal of Extracellular Biology》：The Impact of Different Isolation Methods on Extracellular Vesicle Yield and Composition in human Breast Milk: A Pilot Study
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背景：细胞外囊泡（EVs）参与细胞间通讯，广泛存在于包括母乳（BM）在内的多种生理体液中。证据表明，母乳来源 EVs（BMEVs）影响婴儿健康与发育。为解析 BMEVs 的生化组成与功能，需以最小污染高效分离。方法：研究人员从三位供体样本出发，采用超速离心（U
背景：细胞外囊泡（EVs）参与细胞间通讯，广泛存在于包括母乳（BM）在内的多种生理体液中。证据表明，母乳来源 EVs（BMEVs）影响婴儿健康与发育。为解析 BMEVs 的生化组成与功能，需以最小污染高效分离。方法：研究人员从三位供体样本出发，采用超速离心（UC）、尺寸排阻色谱（SEC）与带电核心珠 Capto Core 柱多模式色谱（CC）三种方法分离 BMEVs，并借助纳米颗粒追踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）、BCA 蛋白定量、Western blot、蛋白质组学与小型 RNA 测序评估得率及 cargo。结果：NTA 显示三种方法粒径与浓度相近，TEM 证实 EVs 存在；颗粒-蛋白比在不同方法间差异显著，SEC 显著高于 UC。Western blot 与蛋白质组学显示 SEC 与 CC 对 EV 相关蛋白富集优于 UC，而 CC 对 α-S1-酪蛋白、乳铁蛋白与 α-乳白蛋白等非 EV 污染物去除最彻底。UC 捕获了更具特异性的 miRNA 谱，包括更高富集的 hsa-miR-16-5p。结论：CC 可在小体积母乳样本中稳定获得 EV 富集组分，在降低共分离污染物同时保留 EV 相关蛋白，且具有成本效益、操作友好与可放大性，有望用于常规研究与临床规模化应用。
研究背景方面，母乳（BM）除营养成异常，还包含母乳来源细胞外囊泡（BMEVs，breast milk-derived extracellular vesicles），这类由脂质双层包裹的纳米颗粒可携带蛋白质、脂质、核酸等生物活性 cargo，参与婴儿肠道成熟、免疫调节与远端器官通讯。然而母乳基质复杂，酪蛋白胶束、乳清蛋白、脂蛋白与细胞碎片在尺寸和密度上与 EVs 高度重叠，常规分离易共分离非 EV 成分，干扰下游组学解读与功能结论。目前缺乏适用于低体积临床样本、兼具高回收率与高纯度的标准化分离方案，因此研究人员开展该项概念验证研究，比较超速离心（UC，ultracentrifugation）、尺寸排阻色谱（SEC，size exclusion chromatography）与多模式核心层析（CC，Capto Core 700 柱，结合分子排阻与带电配基结合）在 1 mL 母乳中的分离表现。
关键技术方法方面，样本来自三位健康足月产妇产后三周的母乳队列，经脱脂与去除细胞碎片后分组分离。研究人员主要依托纳米颗粒追踪分析（NTA）定量颗粒浓度与粒径，透射电子显微镜（TEM）观察形态，BCA 法测总蛋白，Western blot 检测四跨膜蛋白标志物与非 EV 污染标志物，LC-SWATH-MS/MS 数据非依赖采集蛋白质组学按 MISEV2023 框架注释，小型 RNA 测序聚焦 miRNA 图谱，并以重复测量统计控制供体差异。
研究结果部分，首先为基于分离方法的颗粒得率与 EV 纯度评估。NTA 与 BCA 计算显示，SEC 与 CC 的颗粒-蛋白比高于 UC，提示共分离蛋白更少；TEM 下 UC 颗粒少且见聚集体，SEC 与 CC 囊泡更丰富。
其次为颗粒尺寸分布与形态学表征。三种方法中位粒径均在约 170–180 nm，无显著方法学差异，TEM 均确认典型囊泡形态。
第三为 EV 富集与非 EV 蛋白清除比较。Western blot 显示 SEC 与 CC 的 CD9、CD81、CD63 富集高于 UC；CC 中钙连蛋白、GRP94 与乳铁蛋白（LTF）信号最低，说明非 EV 污染最少。
第四为蛋白质组学谱比较。共鉴定 447 种蛋白，SEC 鉴定数最多，CC 次之，UC 最少；PCA 与热图显示 UC 独立于 SEC 与 CC 聚类。按 MISEV2023 分类，CC 提升第 1、2 类 EV 相关蛋白比例，降低第 3 类非 EV 共分离结构比例。
第五为基于 MISEV2023 的 EV 蛋白富集评估。CC 在 EV 相关蛋白上调与非 EV 蛋白下调上表现最优，尤其降低 α-S1-酪蛋白与 κ-酪蛋白共分离。
第六为 BMEV 富集样本的小型 RNA 组成。核心 miRNA 谱在三种方法中稳定，但低丰量 miRNA 具方法选择性；UC 捕获偏非囊泡 RNA 特征更明显。
第七为方法依赖的 miRNA 谱。PCA 显示 UC 与 SEC、CC 明显分离，hsa-miR-16-5p 等在 UC 中高富集，提示可能来自非囊泡共分离物；SEC 与 CC miRNA 轮廓高度相似。
讨论与结论部分，研究人员指出 CC 通过尺寸排阻与电荷/疏水结合双重机制，在保留 EV 完整性的同时更有效去除酪蛋白、免疫球蛋白 corona 与游离核酸污染。相较于 UC 的高剪切压缩 corona，以及 SEC 对短片段 RNA 的容纳偏向，CC 在纯度、时间效率（单样本少于 10 分钟）与可放大性上更具优势。研究受限于三位供体小样本，但多组学一致性支持 CC 可作为低体积母乳样本中 BMEV 高纯分离的可行方案。原文结论强调：CC 隔离策略能以可靠得率回收 BMEVs，在纯度、时间效率与兼容性上优于或与 SEC 和 UC 相当，可降低非囊泡污染物对蛋白与 miRNA 图谱的干扰，为母幼健康研究中的功能性 cargo 解析与临床低体积采样提供实用工具。
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