《Journal of Extracellular Biology》：Extracellular Vesicles Enhance The Coupling of Neurogenesis and Angiogenesis and Neurological Recovery By Transfer of Micrornas After Stroke
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细胞间通讯在卒中诱导的血管生成和神经发生中的潜在机制仍 largely 未知。研究人员假设：来源于缺血性脑内皮细胞（ECs）和神经干细胞（NSCs）的细胞外囊泡（EVs）通过其携带的微小RNA（miRNAs）介导卒中后血管生成与神经发生的偶联。研究人员从培养的
细胞间通讯在卒中诱导的血管生成和神经发生中的潜在机制仍 largely 未知。研究人员假设：来源于缺血性脑内皮细胞（ECs）和神经干细胞（NSCs）的细胞外囊泡（EVs）通过其携带的微小RNA（miRNAs）介导卒中后血管生成与神经发生的偶联。研究人员从培养的非缺血及缺血大鼠ECs和NSCs的条件培养基中分离了细胞类型特异性EVs。EV携带miRNA谱分析显示，缺血性EC-EVs富集miR-125a和miR-146a，而缺血性NSC-EVs富集miR-106b和miR-125b。体外实验中，用缺血性EC-EVs处理非缺血性NSCs显著增加了NSC增殖和分化，并提高了其miR-146a和miR-125a含量。将非缺血性ECs与缺血性NSC-EVs共孵育可显著增强体外血管生成，并伴随EC中miR-106b和miR-125b水平升高。为明确缺血性EV携带的miRNAs是否介导这些效应，研究人员构建了携带特定miRNA模拟物的非缺血性EC-EVs和NSC-EVs。用含有miR-125a或miR-146a模拟物的工程化EC-EVs处理非缺血性NSCs显著增加了神经发生，而用含有miR-106b或miR-125b模拟物的工程化NSC-EVs处理非缺血性ECs显著促进了血管生成。此外，对接受24小时大脑中动脉闭塞（MCAO）的大鼠经鼻给予缺血性NSC-EVs或EC-EVs（每隔一天给药一次，持续两周），显著改善了神经和认知功能恢复。综上，研究数据表明，缺血性EC-和NSC-EVs的携带物，尤其是miRNAs，在卒中恢复期间促进了卒中诱导的神经发生与血管生成的偶联。
论文解读：缺血性细胞外囊泡经miRNA介导神经发生与血管生成偶联促进卒中后功能恢复
一、研究背景与科学问题
卒中是人类长期残疾的主要原因之一，急性缺血性卒中的临床治疗选择十分有限。阐明促进神经血管修复的分子机制，对改善卒中后神经功能具有重要意义。血管生成是预先存在的血管生出新血管的生理过程，卒中可激活相对静息状态的脑内皮细胞（ECs），诱导血管生成，增加侧支循环，且卒中后血管生成的增加与神经功能恢复高度相关。神经发生则是指神经干细胞（NSCs）和祖细胞产生新神经元的过程，成年啮齿动物脑中NSCs定位于脑室下区（SVZ）和海马齿状回（DG），且与ECs毗邻。卒中可诱导神经发生，新生成的神经母细胞向缺血区迁移。既往研究已表明卒中诱导的血管生成和神经发生是偶联的。然而，介导这一偶联过程的细胞间通讯机制尚未充分阐明。近年单细胞转录组测序研究显示，成年神经发生区内皮细胞是NSC微环境中最富集的细胞群之一，提示血管来源信号可能调控神经发生；同时，SVZ的NSCs也表达多种调控血管生成的基因。因此，ECs和NSCs可能通过双向交互作用偶联神经发生与血管生成，但协调这些过程的细胞间通讯机制仍不清楚。细胞外囊泡（EVs）是细胞来源的囊泡，其携带大量源于亲代细胞的生物分子，可通过向受体细胞转移内容物（包括miRNAs）介导细胞间通讯。基于此，研究人员提出假设：卒中恢复期来源于缺血性ECs和NSCs的EVs通过其携带的miRNAs调控血管生成与神经发生的偶联。
二、研究内容与主要结论
研究人员围绕上述假说开展了一系列体外和体内实验。在体外，研究人员分别从非缺血和缺血大鼠培养的ECs和NSCs条件培养基中分离出细胞类型特异性EVs，通过miRNA芯片分析其miRNA谱；用缺血性EC-EVs处理非缺血性NSCs，检测NSC增殖和分化；用缺血性NSC-EVs处理非缺血性ECs，检测血管生成能力；并通过构建携带特定miRNA模拟物的工程化EVs验证功能miRNAs的作用。在体内，研究人员采用经鼻给药方式，将缺血性EC-EVs或NSC-EVs给予大脑中动脉闭塞（MCAO）模型小鼠，评估神经功能恢复。主要结论包括：缺血性EC-EVs富含miR-125a和miR-146a，可被NSCs摄取并促进NSC增殖和神经元分化；缺血性NSC-EVs富含miR-106b和miR-125b，可被ECs摄取并促进血管生成；经鼻给予缺血性EC-EVs或NSC-EVs显著改善缺血小鼠的感觉运动功能和认知功能。该研究首次揭示了EV携带的miRNAs在卒中后神经发生与血管生成偶联中的关键介导作用，为卒中后神经血管重塑的治疗提供了新靶点和新策略。
三、关键技术方法
本研究主要采用以下关键技术方法：（1）EV分离与表征：通过差异超速离心从培养细胞条件培养基中纯化EVs，并运用Western blot检测EV标志蛋白（CD63、CD9、Alix）、透射电镜（TEM）观察形态、NanoSight分析粒径分布；（2）miRNA谱分析：利用miRNA微阵列芯片比较缺血和非缺血EC-EVs及NSC-EVs的miRNA表达谱，并通过实时定量RT-PCR验证差异表达的miRNAs；（3）Cre-LoxP报告系统：将携带Cre重组酶的质粒转染ECs，分离Cre+ EVs处理Rosa-TdTomato报告小鼠来源的NSCs或经鼻给予报告小鼠，通过RFP信号追踪EVs的体内外摄取；（4）Ago2 RNA免疫沉淀（Ago2-RIP）：检测EV中与Ago2结合的miRNAs富集情况；（5）工程化EVs制备：通过电穿孔将miRNA模拟物转染非缺血ECs或NSCs，收集其条件培养基分离富集特定miRNAs的EVs；（6）动物模型与行为学评价：采用永久性MCAO模型，经鼻给予EVs，通过粘性去除实验、足失误实验、改良神经功能严重程度评分（mNSS）、三室社交实验和Morris水迷宫评估神经功能。样本来源于雄性Wistar大鼠（3–4个月，100–300 g）和雄性C57BL/6J小鼠（3–4个月，20–30 g），EVs分离自MCAO后7天大鼠的SVZ NSCs和脑皮质ECs。
四、研究结果
1. 缺血性EC-EVs在体外促进神经发生
从MCAO后7天大鼠分离的脑ECs条件培养基中纯化EC-EVs，Western blot证实其表达EV标志物Alix、CD63和内皮标志物CD31，不表达核污染标志物Histone H3和高尔基体标志物GM130；TEM显示100–200 nm的膜性结构。用缺血性EC-EVs处理非缺血性NSCs，在增殖培养基中，BrdU+增殖细胞数量较非缺血性EC-EVs和PBS组显著增加；在分化培养基中，Tuj1+神经母细胞和NG2+少突胶质前体细胞（OPCs）数量显著增加；RT-PCR显示β-tubulin III、NG2、SOX2和Mash1 mRNA水平升高。
2. EC-EVs被NSCs内化
利用Cre-LoxP系统，将携带Cre重组酶的EC-EVs与Rosa-TdTomato报告小鼠SVZ来源的NSCs共孵育48 h，NSCs中出现RFP信号，并与nestin+神经祖细胞、Tuj1+神经母细胞和GFAP+星形胶质细胞共定位，证明EC-EVs可被NSCs内化并传递功能性货物。
3. 缺血性EC-EVs具有独特的miRNA谱
miRNA芯片共检出164个miRNAs，其中91个与亲代ECs重叠。IPA分析显示缺血性EC-EVs中上调miRNAs的靶基因富集于炎症、细胞周期G1/S转换、分化、迁移和增殖等通路。RT-PCR验证了前3个富集miRNAs：miR-146a、miR-125a和miR-411。Ago2-RIP显示miR-146a和miR-125a在缺血性EC-EVs的Ago2复合物中高度富集，而miR-759无显著变化。
4. 缺血性EC-EVs通过miR-146a和miR-125a促进NSC增殖和神经元分化
NSCs与缺血性EC-EVs共孵育后，miR-146a、miR-125a-5p和miR-411水平显著升高。用携带miR-146a或miR-125a模拟物的工程化EC-EVs处理NSCs，BrdU+、Tuj1+、GFAP+和NG2+细胞均显著增加；同时miR-146a靶基因TRAF6和miR-125a靶基因BAK1、KLF13的mRNA和蛋白水平显著降低。表明缺血性EC-EVs通过传递miR-146a和miR-125a作用于靶基因，促进体外神经发生。
5. 缺血性NSC-EVs在体外促进血管生成
从MCAO后7天大鼠SVZ NSCs条件培养基中分离NSC-EVs。与PBS相比，非缺血性NSC-EVs处理ECs显著增加毛细血管样管形成长度和细胞迁移；而缺血性NSC-EVs较非缺血性NSC-EVs进一步显著增强管形成和内皮迁移。表明NSC-EVs（尤其缺血性来源）可促进体外血管生成。
6. 缺血性NSC-EVs具有独特的miRNA谱
miRNA芯片在缺血性NSC-EVs中检出318个miRNAs，其中84个与亲代NSCs重叠。IPA分析显示缺血性NSC-EVs中上调miRNAs的靶基因涉及炎症、增殖、细胞周期、细胞死亡和分化等通路。RT-PCR验证了前3个上调miRNAs：miR-106b-3p、miR-542-5p和miR-125b-3p。用缺血性NSC-EVs处理ECs后，受体EC中这三种miRNAs水平显著升高。携带miR-106b或miR-125b模拟物的非缺血性NSC-EVs可显著增强管形成。Ago2-RIP证实miR-106b和miR-125b在缺血性NSC-EVs的Ago2复合物中高度富集。
7. 体内EV摄取及其miRNAs的传递
经鼻给予携带Cre重组酶的非缺血性EC-EVs至Rosa-TdTomato报告小鼠，14天后在SVZ前角和海马DG检测到RFP信号，且RFP+细胞包括GFAP+星形胶质细胞、NeuN+神经元、胼胝体少突胶质细胞和PDGFRβ+周细胞，表明EC-EVs可经鼻入脑并被脑实质细胞摄取。MCAO小鼠经鼻给予缺血性EC-EVs后，同侧SVZ和海马组织中miR-146a和miR-125a水平显著升高。
8. 缺血性EC-和NSC-EVs改善卒中后感觉运动功能和认知功能
MCAO后24 h开始经鼻给予缺血性EC-EVs（每隔一天一次，持续两周），自第3天起显著改善足失误、粘性去除和mNSS评分，并增加社交新异性探索时间。缺血性NSC-EVs同样显著降低mNSS、缩短粘性去除时间和减少足失误频率，增加社交新异性探索时间，并在Morris水迷宫中显著缩短到达平台时间、增加目标象限停留时间。
五、讨论与结论
讨论部分指出，本研究揭示了NSCs与ECs之间通过携带miRNAs的EVs进行串扰的机制：缺血性EC-EVs被非缺血性NSCs摄取以促进神经发生，而缺血性NSC-EVs被非缺血性ECs摄取以促进血管生成，EVs作为共同介质同时影响这两个过程。缺血性EC-和NSC-EVs各自具有与非缺血性来源不同的miRNA谱，提示它们通过不同调控机制发挥作用。研究利用Cre-LoxP系统证实了EVs在体外和体内的摄取，且EVs不仅能通过鼻黏膜和神经通路绕过血脑屏障（BBB）入脑，还可被脑内多种细胞摄取，包括神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和周细胞。关于miR-411在受体NSCs中升高幅度大于EV中富集程度的现象，研究排除了内源转录激活，认为主要源于低基础水平、EV传递积累和缺血预处理增强摄取。miR-106b和miR-125b已知可靶向PTEN和TP53INP1等促进EC存活和迁移，支持其在NSC-EV诱导血管生成中的作用。研究还通过Ago2-RIP发现EV携带的miRNAs高度富集于Ago2复合物，提示其可能组装为功能性miRISC。讨论同时承认若干局限性：未在行为学评估中设置非缺血性EV治疗组；EVs被多种细胞摄取，功能恢复不能完全归因于神经血管重塑；需要更多体内研究验证ECs和NSCs的特异性效应；U6作为EV相关RNA内参存在争议；未使用miRNA抑制剂反向验证；且研究仅在雄性动物中进行，尚需在雌性动物中验证。
结论部分（原文翻译）：研究数据表明，来源于缺血性ECs和NSCs的EVs分别促进神经发生和血管生成。研究还显示，在缺血条件下EC-和NSC-EVs表现出不同的miRNA谱，这些miRNAs介导了神经发生和血管生成的偶联。缺血性EC-EVs和缺血性NSC-EVs可增强卒中后神经功能的改善。因此，这些EVs具有放大卒中人群脑神经血管重塑的治疗潜力。
