面向跨生物界高纯细胞外囊泡与纳米囊泡抗氧化活性定量的标准化微孔板ABTS/ORAC方法：自空白校正与膜破坏分层评估

《Journal of Extracellular Vesicles》：Standardized Microplate-Based Assays for Quantifying Antioxidant Activity in Extracellular Vesicles and Nanovesicles Across Biological Kingdoms

　　

细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）和纳米囊泡的抗氧化活性日益与其生理及治疗功能相关联，但其准确定量仍受限于EV产量低、共分离污染物以及缺乏标准化方法。在此，研究人员建立了针对经超速离心（ultracentrifugation, UC）联合尺寸排阻色谱（size-exclusion chromatography, SEC）（UC + SEC）获得的高纯度EV和纳米囊泡而优化的微孔板ABTS（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)）和ORAC（oxygen radical absorbance capacity）方案。通过减少样本输入量、实施基于蛋白的归一化（TEAC/g EV protein），并引入测定特异性对照——包括ORAC的自空白校正——研究人员在植物、人血浆和细菌来源的EV及纳米囊泡中实现了灵敏且可重复的测量。结果表明，常规分离方法因非囊泡污染物而显著高估抗氧化活性，凸显严格纯化的必要性。采用与ABTS兼容的去垢剂破坏策略，研究人员进一步区分表面相关与货物来源的抗氧化活性，揭示EV的两层功能组织。值得注意的是，研究人员首次报道细菌细胞外囊泡（bacterial extracellular vesicles, BEVs）中可检测到抗氧化活性。将这些方法应用于一项人类膳食干预显示，EV抗氧化能力在体内受到动态调节。总体而言，该工作为跨生物界可靠评估EV和纳米囊泡抗氧化特性提供了标准化且广泛适用的框架。

细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）和纳米囊泡的抗氧化活性与其生理及治疗功能日益相关，但准确定量受限于EV产率低、共分离污染物和标准化方法缺失。该研究由Juan Antonio Nieto等开展，论文发表在《Journal of Extracellular Vesicles》，旨在建立适用于高纯度EV和植物来源纳米囊泡（plant-derived nanovesicles, PDNVs）的微孔板ABTS（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)）与ORAC（oxygen radical absorbance capacity）标准化定量框架，解决既往单步分离、异质报告单位和污染物干扰导致的高估问题。研究人员以UC + SEC纯化EV，优化低样本输入、蛋白归一化（TEAC/g EV protein）和ORAC自空白校正，建立与ABTS兼容的去垢剂膜破坏策略以区分表面与货物抗氧化活性，并将方法拓展至植物、人血浆和细菌来源EV。研究结论指出严格纯化可避免非囊泡成分造成的高估，蛋白归一化适用于相近EV群体比较，完整EV以表面活性为主、货物释放后活性增强，ORAC具高分析灵敏度而ABTS结合破坏策略用于总抗氧化潜力评估；该研究首次报道细菌EV抗氧化活性及膳食干预可动态调节人血浆EV抗氧化能力，为跨生物界EV抗氧化功能的质量控制、机制研究和转化应用提供可重复方法学框架。

关键技术方法概括：以UC + SEC制备高纯EV/纳米囊泡；采用纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）、透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）、BCA（bicinchoninic acid）蛋白定量和Western blot表征；优化微孔板ABTS、DPPH（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl）和ORAC，建立Trolox标准曲线、LoD/LoQ及spike-in基质效应评估；使用1% SDS（sodium dodecyl sulfate）、Triton X-100和saponin进行膜破坏兼容性验证；开展两实验室间验证；人血浆样本来自已发表羟基酪醇补充研究（11名健康志愿者，基线、30、60、120 min及1周）；采用细胞ROS（reactive oxygen species）和MTT评估；BEVs来源于Pseudomonas aeruginosa PAO1。

结果部分：

3.1 Development of Microplate-Based Antioxidant Assays Adapted to PDNVs and EVs：研究人员将ABTS、DPPH和ORAC微型化并优化，以适配低输入、高纯EV，避免共分离偏倚。

3.1.1 Optimization of the ABTS Radical Assay for Measuring Antioxidant Activity of Isolated PDN-Vs：建立2、5、25 μL样本条件，Trolox标准曲线IC₅₀分别为2.709、1.132和0.227 mM，CV<10%；2 μL条件对西兰花来源纳米囊泡灵敏度不足。

3.1.2 Optimization of the DPPH Radical Assay for Antioxidant Activity Assessment of Purified PDNVs：DPPH微型化后对纯化EV无可见自由基抑制，且样本光学干扰使吸光度升高，提示不适用于EV。

3.1.3 Optimization of the ORAC Assay for Measuring Antioxidant Activity of Isolated PDNVs：优化荧光素800 nM、AAPH 153 mM、37°C，建立Trolox曲线；EV加入导致初始荧光下降，采用自空白校正后由169.11 ± 1.20提高至195.32 ± 1.29 μM Trolox/L，避免低估。

3.2 Optimization of PDNV Disruption Protocols for Assessing Total Antioxidant Activity：研究人员比较SDS、Triton X-100和saponin破坏PDNV膜以评估货物贡献。

3.2.1 Compatibility of Disruption Agents With ABTS and ORAC Assays：ABTS中SDS可用至1%，Triton X-100需限0.1%，saponin限0.01%；工作浓度设为1% SDS、0.1% Triton X-100和0.03% saponin。

3.2.2 Disruption Unmasks Cargo-Derived Activity in Loaded PDNVs：酚类负载PDNV经去垢剂破坏后ABTS活性高于未处理对照，羟基酪醇负载增加最大，证明破坏可释放货物抗氧化活性。

3.2.3 Disruption Agents Are Incompatible With ORAC Assay：三种去垢剂均干扰荧光素或AAPH动力学，不适用于ORAC总抗氧化能力评估。

3.3 Application to PDNVs and EVs：研究人员将优化方法用于多种植物来源PDNV及EV。

3.3.1 Antioxidant Activity Decreases Dramatically Upon Purification：ORAC和ABTS均显示从初始提取物到UC沉淀再到UC + SEC纯化EV，活性下降>90%，多数纯化样本<1%，姜来源保留较高；1% SDS仅使部分纯化样本活性增加。

3.3.2 Apoplastic Fluids Confirm Low Antioxidant Activity of Purified EVs：以Nicotiana benthamiana叶片质外体洗液（apoplast wash fluid, AWF）分离EV，标记分析支持EV富集且胞质/叶绿体污染低；随纯化步骤活性递降，SEC纯化EV活性很低，支持植物EV基础抗氧化能力有限。

3.3.3 Analytical Sensitivity and Matrix Effects of the ORAC Assay in PDNV Preparations：LoD/LoQ呈基质依赖，柠檬和蓝莓PDNV约0.003–0.013 g/L蛋白和0.008–0.040 g/L蛋白，甜瓜较高；spike-in回收约91%–100%，偏差<10%，基质效应可忽略。

3.3.4 Influence of Botanical Origin：姜、草莓和西兰花来源EV在ORAC和ABTS中原始活性较高；蛋白归一化后姜仍最高，ABTS蛋白归一化差异较小。

3.3.5 Protein Normalization Enables Cross-Sample Comparison：ORAC活性与蛋白含量总体弱相关（r²=0.2851），排除姜后r²=0.7877；ABTS与蛋白强相关（r²=0.8497）；与NTA颗粒浓度相关性弱。

3.3.6 Isolation Method Influences Antioxidant Activity：探索性比较UC、PEG沉淀和TFF，纯化后活性明显下降，提示较少纯化制备中共分离成分贡献大。

3.3.7 Co-Isolate Contaminants Retain a High Antioxidant Activity：SEC 40个组分分析显示污染物富集组分抗氧化活性常高于EV富集组分；蛋白低于0.01 mg/mL的组分蛋白归一化需谨慎。

3.3.8 Standardized Assays Enable Consistent Interlaboratory Quantification：两实验室对6种植物来源PDNV验证，ORAC、ABTS和ABTS-SDS分别有5/6、5/6、5/6达到CV<20%，Pearson r分别为0.98、0.95、0.90，Spearman rho均为0.89；实验室内重复性呈 assay、组分和基质依赖。

3.4 Antioxidant Activity of Plasma-Derived EVs in Response to Dietary Intervention：将方法用于羟基酪醇补充的人血浆EV。

3.4.1 Time-Dependent Changes in Antioxidant Activity：ORAC显示总抗氧化活性60 min达峰并伴随EV蛋白增加，1周后多数志愿者高于基线；蛋白归一化后ORAC和pooled ABTS比活性30 min最高。

3.4.2 Protein Content as a Normalization Metric for Extracellular Vesicles Antioxidant Activity：基线ORAC活性与蛋白含量强相关（r²=0.8496），全部时间点合并r²=0.6318；与颗粒浓度相关性弱（r²=0.1061），支持蛋白归一化。

3.5 Antioxidant Activity of BEVs：评估Pseudomonas aeruginosa来源BEVs。

3.5.1 Protein Normalization for Cross-Kingdom EV Comparisons：植物与哺乳动物EV合并时ORAC与蛋白中度相关（r²=0.5829），加入BEVs后降至r²=0.0117；颗粒浓度相关性亦弱，提示跨生物界蛋白归一化需谨慎。

3.6 PDNVs Exhibit Cell-Type Dependent Redox and Viability Effects：4 h时所有PDNV不同程度降低EA.hy926内皮细胞ROS，化学抗氧化活性与细胞ROS呈中等负相关；24 h时ROS和细胞活力呈细胞类型及来源依赖，提示ORAC/ABTS应作为筛选指标而非细胞抗氧化功效的直接替代。

讨论部分总结：该研究系统优化了EV抗氧化测定，指出ABTS与ORAC机制互补，ORAC自空白校正可纠正EV诱导的荧光淬灭；强调严格纯化是避免非囊泡可溶性成分高估活性的关键，但SEC也可能部分去除EV生理相关corona成分；去垢剂破坏揭示完整EV以表面相关活性为主、货物释放后活性增强；BEV抗氧化活性主要为膜相关，且首次报道其可测抗氧化活性；蛋白归一化适用于相近来源EV比较，跨生物界尤其含BEV时需谨慎。研究局限包括未直接评估血浆EV脂蛋白污染、无安慰剂或时间匹配对照、去垢剂裂解效率未直接验证、实验室间验证仅用PDNV、化学测定不能完全反映细胞功能等。

研究结论翻译：研究人员开发并分析验证了适用于高纯度EV抗氧化活性测定的优化微孔板ABTS和ORAC方法，可应用于植物、人血浆和细菌来源。结果表明：（i）严格纯化对于减少共分离可溶性成分造成的EV抗氧化活性高估至关重要，尽管高严格度纯化也可能部分去除生理相关EV corona成分；（ii）以蛋白含量归一化（mmol Trolox/g protein）提供实用且广泛可及的指标，在纯化样本中与EV丰度强相关并便于相近EV群体比较，而跨生物界比较应谨慎解释；（iii）完整EV主要表现表面活性，货物释放后能力增强；（iv）优化ORAC经LoD/LoQ和spike-in回收验证，具高分析灵敏度且基质干扰小，适合检测高纯EV低抗氧化活性；ABTS结合经验证的破坏方案对评估总抗氧化潜力不可或缺。重要的是，研究人员首次显示EV抗氧化活性可经膳食补充在体内调节，并首次报道P. aeruginosa来源BMVs具有可测抗氧化特性。总体而言，这些方法学进展连同分析验证和细胞水平 redox 效应评估，为跨生物来源EV相关抗氧化活性定量提供了标准化、可重复的框架，并促进机制与转化研究。