《Journal of Extracellular Vesicles》：Heparan Sulfate Differentially Regulates Fibroblast Binding by Extracellular Vesicles and Human Cytomegalovirus
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细胞外囊泡（EVs）是由细胞产生的脂质包裹颗粒，作为细胞间通讯和货物交换的载体。病毒感染细胞可产生货物发生改变的EVs，其中可包括病毒组分。这些EVs在病毒感染的多个方面发挥功能作用。其与细胞的相互作用，包括内化前在细胞表面发生的相互作用，对其后续功能效应至关
细胞外囊泡（EVs）是由细胞产生的脂质包裹颗粒，作为细胞间通讯和货物交换的载体。病毒感染细胞可产生货物发生改变的EVs，其中可包括病毒组分。这些EVs在病毒感染的多个方面发挥功能作用。其与细胞的相互作用，包括内化前在细胞表面发生的相互作用，对其后续功能效应至关重要，但尚未得到广泛研究。在本工作中，研究人员研究细胞糖胺聚糖（GAGs）——细胞外基质（ECM）的主要成分——在稳态细胞及感染人巨细胞病毒（HCMV）的细胞所产生EVs的细胞结合中的作用。研究人员显示，来自感染和未感染细胞的EVs均与肝素相互作用，肝素是硫酸乙酰肝素（HS）的高度硫酸化形式。然而，在结合成纤维细胞的背景下，研究人员显示细胞和EV表面的HS均抑制EV-细胞相互作用，同时促进HCMV附着。EVs并非利用GAGs，而是与成纤维细胞表面的其他ECM成分，即胶原和纤连蛋白相互作用。本工作表明，HS作为EVs与成纤维细胞结合的双向负调控因子，同时作为HCMV附着的正调控因子。因此，在稳态和HCMV感染期间，EVs与HCMV似乎利用不同且不重叠的ECM配体进行细胞结合。
研究背景方面，EVs由细胞持续分泌，是稳态和病理条件下细胞间通讯的重要方式，其部分功能依赖细胞摄取，而摄取前首先发生EV与细胞表面的相互作用；病毒感染细胞还可释放携带病毒组分或货物改变的EVs，这些EVs参与病毒感染的多个环节。与此同时，HCMV等病毒进入细胞前亦需与细胞表面初始结合。由于病毒感染细胞可共同产生EVs和病毒颗粒，且二者具有重叠的生物物理特性，明确介导其初始细胞相互作用的因素十分重要。GAGs是ECM和基底膜中丰富的一类聚糖，包括透明质酸（HA）、硫酸软骨素（CS）、硫酸皮肤素（DS）、硫酸乙酰肝素（HS）和硫酸角质素（KS）等；HS和CS分别以硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPGs）和硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPGs）形式广泛存在于组织中。既有研究表明EVs和HCMV均可结合肝素并利用HS结合多种细胞，但此前尚无研究直接比较共分离的EVs与病毒同GAGs的相互作用，以判断二者是否利用相同配体进行细胞结合；HS是否为EV-细胞结合的普遍介导因素、病毒感染如何改变这些相互作用、共产生的EVs与病毒是否共享细胞配体机制等问题尚待澄清。这些问题对于理解病毒感染细胞释放EVs向邻近初始细胞传递病毒病原相关分子模式（PAMPs）等功能，以及开发靶向性EV治疗策略均具重要性。基于此，研究人员系统表征并比较了HCMV感染的成纤维细胞与未感染成纤维细胞来源EVs同初始受体细胞的相互作用，重点分析GAGs在其中的作用。该研究发表于《Journal of Extracellular Vesicles》，其意义在于揭示HS对EVs与HCMV细胞结合具有差异性调控作用，并提示二者利用不同且不重叠的ECM配体。方法上，研究人员使用人包皮成纤维细胞（HFF；Hs27，ATCC）及HCMV Merlin R1111株制备感染与未感染条件培养基；以密度垫高速离心分离病毒颗粒与无病毒颗粒EVs，并经超滤和尺寸排阻色谱（SEC）纯化及AF647标记。采用透射电镜（TEM）、纳米流式细胞术（nFC）、蛋白质印迹（WB）和酶联免疫吸附试验（ELISA）表征EVs；用GAG寡糖微阵列分析糖胺聚糖结合谱；以肝素酶、软骨素酶及胶原酶/中性蛋白酶处理细胞或EVs；通过共聚焦显微镜EV细胞结合实验、定量PCR（qPCR）病毒结合实验及固相结合实验评估结合。结果部分：3.1 EVs Can Be Separated From HCMV Viral Particles Based on Density and They Display Characteristic EV Markers。研究人员通过密度垫离心分离、SEC纯化和多方法表征，发现纯化EVs在TEM下呈典型圆形/椭圆形形态且未见病毒颗粒，nFC显示两类EVs粒径分布相似、峰值约60 nm，AF647标记有效，并能检测到CD63、CD81、β-actin以及纤连蛋白和钙联蛋白；结论是EVs可依据密度与HCMV病毒颗粒分离，并具有典型EV标志物。3.2 EVs Interact With Heparin and Heparin Inhibits EV-Cell Interactions。通过GAG寡糖微阵列和共聚焦EV细胞结合实验，研究人员发现两类EVs主要与肝素结合，结合呈链长依赖性，而与HA和CS结合很少或无结合；外源肝素使未感染EVs和HCMV感染EVs的细胞结合分别降低58.9%和61.7%；此外，感染细胞来源EVs的基线细胞结合低于未感染来源EVs，降低约58%（p=0.0049），且结合模式更趋于离散。结论是EVs与肝素相互作用，肝素可抑制EV-细胞结合。3.3 Fibroblast Heparan Sulfate Inhibits Binding by EVs but Promote Binding by HCMV。通过流式细胞术和共聚焦确认HFF表面存在HS和CS，并用肝素酶I/III或软骨素酶ABC去除相应GAGs后开展EV结合与HCMV结合实验，研究人员发现去除HS使未感染EVs结合增加2.5倍（p=0.0020），使感染EVs结合增加1.7倍但未达统计学显著（p=0.176），去除CS不影响EV结合；相反，去除HS使HCMV结合下降13.2倍（降低92.4%），去除CS无影响；HA和KS未在HFF细胞检测到。结论是成纤维细胞表面HS抑制EV结合而促进HCMV结合。3.4 EV-associated Heparan Sulfate Inhibits EV-Cell Interactions。通过肝素酶I/III或软骨素酶ABC处理纯化EVs并以ELISA检测SEC组分中的CD63、HS和CS，研究人员确认EVs携带HS和CS且可被相应酶特异性去除，nFC显示酶处理未改变EV粒径分布和AF647标记；共聚焦结合实验显示HS缺失EVs的细胞结合增加2.0倍（p=0.044），CS缺失EVs结合无主要变化。结论是EV表面HS亦抑制EV-细胞相互作用。3.5 Collagen and Fibronectin Promote Cellular Surface Binding by EVs。通过固相结合实验，研究人员发现未感染和HCMV感染来源EVs均结合I型胶原和纤连蛋白，而不结合IV型胶原；免疫染色确认HFF表面存在相关蛋白，胶原酶I与dispase II处理后，未感染EVs结合下降37.7%（p=0.017），感染EVs结合下降51.3%（p=0.0038）。结论是I型胶原和纤连蛋白促进EVs与成纤维细胞表面结合。讨论部分总结认为，该研究首次报道HS可以双向方式抑制EV-细胞相互作用，同时促进HCMV附着，从而将HS界定为EVs与HCMV成纤维细胞结合的差异性调控因子。讨论指出，EVs与肝素结合并不必然意味着细胞HS是功能性结合伙伴；肝素较高硫酸化和较强负电荷、HS结构域空间组织、肝素诱导EV聚集以及EV亚群差异等均可解释EV与肝素结合但细胞结合不依赖HS的现象，且肝素结合对EV纯化具有潜在价值但可能带来亚群偏倚。讨论还提出，细胞和EV表面的HS均带负电，去除任一侧HS可减少静电排斥；EV携带GAGs还可能影响生长因子、细胞因子等信号因子 sequestration。HCMV感染来源EVs基线结合降低提示感染时促进细胞相互作用的EV因素发生失调，EV转运不同于稳态。胶原和纤连蛋白被确认为未感染及感染来源HFF EVs的真实结合伙伴，而其作为细胞表面配体的作用此前未被充分研究。讨论同时强调研究限于成纤维细胞这一顺式相互作用模型，EV异质性及SEC体相分离限制了对单个EV亚型GAG结合和细胞结合特性的解析，且EV“corona”等复杂因素未直接涉及；未来应将糖微阵列拓展至N-聚糖、O-聚糖和糖脂等其它聚糖类别。研究结论翻译：本研究为HS在调控EV-细胞相互作用中的作用、以及EVs与病毒在此方面的差异提供了新见解，并应促进针对这些相互作用的新研究，无论是靶向性还是广谱性研究。
