幽门螺杆菌感染重塑中性粒细胞来源细胞外囊泡并经LL-37富集驱动感染胃上皮细胞应激与凋亡

《Journal of Extracellular Vesicles》：Helicobacter pylori Infection Remodels Neutrophil-Derived Extracellular Vesicles, Promoting Stress and Apoptosis in Infected Epithelial Cells

　　

Helicobacter pylori（H. pylori）是一种革兰氏阴性菌，可在人胃内定植，估计感染全球超过一半人口。其被认为是慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌的重要致病因子。中性粒细胞在针对H. pylori的先天防御中发挥核心作用；然而，中性粒细胞活化失调会促进上皮损伤和持续炎症。本研究表明，H. pylori增强中性粒细胞胞吐作用，并刺激释放具有独特生物物理和分子特征的细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）。与未感染对照相比，感染中性粒细胞释放的EVs更小且更丰富。这些H. pylori诱导的中性粒细胞EVs（HPN-EVs）抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号，增加活性氧（reactive oxygen species，ROS），破坏线粒体完整性，并诱导感染胃上皮细胞中细胞色素c（cytochrome c）释放、半胱天冬酶（caspase）活化和凋亡。蛋白质组学分析显示，中性粒细胞颗粒蛋白尤其LL-37富集，而与细胞稳态相关蛋白减少。EV介导的LL-37递送再现了HPN-EVs的关键促凋亡效应，支持其在上皮损伤中的功能作用。与这些发现一致，H. pylori感染患者循环EVs显示LL-37水平升高，并诱导相似的促凋亡反应。总之，这些发现将富含LL-37的HPN-EVs确定为中性粒细胞-上皮细胞串扰的重要介质，并提示EV相关货物可作为H. pylori相关疾病的潜在治疗靶点。

H. pylori是WHO第I类致癌原，与慢性胃炎、消化性溃疡和胃腺癌密切相关；其虽激发强烈免疫反应，却可逃避免疫清除并长期定植。中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophils，PMNs）是感染早期主要应答者，适度活化有助于清除病原体，但过度或持续活化可通过释放抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）、蛋白酶、ROS及EVs造成上皮损伤和持续炎症。EVs可携带蛋白质、miRNAs、代谢物等参与细胞间通讯，但H. pylori是否重塑中性粒细胞来源EVs、其货物如何影响胃上皮细胞命运尚需阐明。LL-37为阳离子AMPs，兼具杀菌和免疫调节功能，中性粒细胞是其重要来源，EVs可能保护并递送LL-37。基于此，研究人员提出H. pylori感染增强中性粒细胞胞吐并促进EV释放，HPN-EVs通过递送LL-37等货物促进感染胃上皮细胞氧化应激、线粒体功能障碍和凋亡。该论文发表于《Journal of Extracellular Vesicles》。研究意义在于揭示EV介导的中性粒细胞-上皮细胞串扰机制，并将LL-37富集HPN-EVs及其货物视为H. pylori相关疾病潜在干预靶点。

关键技术方法（不超过250字）：研究使用健康供者（25 ± 5岁）外周血分离的人中性粒细胞，以及经胃活检H. pylori培养确诊的18–65岁患者和健康对照血清样本；采用差速离心联合超速离心分离EVs，并以纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）、扫描/透射电子显微镜（SEM/TEM）和免疫印迹表征EVs；用流式细胞术检测ROS、凋亡、线粒体膜电位（ΔΨ_m）和细胞色素c（Cyt-C）释放；以LC-MS/MS进行EV蛋白质组学分析，ELISA和qRT-PCR检测LL-37及相关因子；并开展EV摄取、蛋白酶保护、LL-37装载及功能干预实验。

研究结果：
3.1 Pylori Infection Enhances Neutrophil Exocytosis and EV Secretions——感染中性粒细胞6 h活力>80%；NTA、免疫印迹及SEM/TEM显示HPN-EVs较N-EVs更小、产量更高，表达CD63/CD9且不富集CagA/VacA。
3.2 Effects of N-EVs and HPN-EVs on AGS Cell Viability——MTT显示10 μg/mL或约2.5×10⁴ EVs/细胞为非细胞毒性剂量，高剂量HPN-EVs降低AGS活力。
3.3 Neutrophil-Derived EVs Are Efficiently Internalized by Gastric Epithelial Cells——PKH67标记、共聚焦和流式显示AGS经肌动蛋白依赖途径内化EVs。
3.4 HPN-EVs Amplify Oxidative Stress in H. pylori-Infected Gastric Epithelial Cells——H₂DCFDA流式显示HPN-EVs在感染AGS中增强ROS，呈摄取和剂量依赖，EV富集组分作用强于EV缺失分泌组。
3.5 HPN-EVs Amplify Apoptosis and Inhibit PI3K-Akt Signalling in H. pylori-Infected Gastric Epithelial Cells——Annexin V/PI和免疫印迹显示HPN-EVs在感染条件下增强凋亡并抑制PI3K/Akt磷酸化。
3.6 HPN-EVs Induce Mitochondrial Dysfunction and Caspase-Dependent Apoptosis in H. pylori-Infected Gastric Epithelial Cells——JC-1、Cyt-C、caspase-9/3及PGC1-α/ATP检测显示线粒体去极化、Cyt-C释放和caspase依赖凋亡；LY294002可模拟相关效应。
3.7 HPN-EVs Potentiate Pro-Inflammatory Cytokine Upregulation during H. pylori Infection——ELISA显示HPN-EVs增强感染AGS的IL-8、TNF-α、IL-1β、IL-6等分泌，IL-10未见显著改变。
3.8 Proteomic Profiling of HPN-EVs Reveals Infection-Specific Cargo and Immune Modulatory Proteins——LC-MS/MS显示HPN-EVs蛋白谱改变，富集中性粒细胞颗粒蛋白（LL-37/CAMP、MPO、ELANE等）及抗菌/免疫调节蛋白，下调稳态相关蛋白。
3.9 HPN-EVs Serve as Vesicles for LL-37 Delivery in H. pylori Infection——免疫印迹、蛋白酶保护、流式和ELISA显示LL-37主要位于囊泡内，HPN-EVs向AGS递送LL-37且依赖肌动蛋白内化，不诱导内源LL-37转录。
3.10 LL-37 Enhances Oxidative Stress and Apoptosis in H. pylori-Infected AGS Cells——外源LL-37在感染AGS中增强ROS和凋亡，未感染时作用较小。
3.11 LL-37 Exacerbates Mitochondrial Dysfunction and Intrinsic Apoptosis in H. pylori-Infected Cells——JC-1、Cyt-C和caspase-9/3显示LL-37加重感染细胞线粒体功能障碍和内在凋亡。
3.12 LL-37–Loaded N-EVs Enhance Apoptosis——超声装载LL-37的N-EVs呈剂量依赖性增强感染AGS凋亡。
3.13 Live H. pylori and Complete LL-37 Sequence Are Essential for Inducing Mitochondrial Dysfunction and Apoptosis——仅活H. pylori联合完整LL-37引起ROS和凋亡，热灭活菌或scrambled LL-37（sLL-37）无效。
3.14 ROS-Mediated Apoptosis in LL-37-Treated H. pylori-Infected AGS Cells——NAC清除ROS降低LL-37联合H. pylori诱导的凋亡，TBHP可模拟氧化应激效应。
3.15 Circulating EVs From H. pylori-Infected Patients are Enriched in LL-37 and Promote Epithelial Apoptosis——患者血清EVs（HPS-EVs）LL-37升高并增强AGS凋亡，与H. pylori共处理作用更强；HPN-EVs作用更显著。

讨论与结论：讨论指出，中性粒细胞过度活化可造成上皮损伤；EV生成与胞吐共享囊泡运输和SNARE介导膜融合通路，ROS和Ca²⁺流可能共同触发颗粒动员及多囊泡体形成。HPN-EVs更小更多，提示感染重塑中性粒细胞囊泡输出。HPN-EVs抑制PI3K/Akt生存信号，使感染上皮细胞转向凋亡；ROS initially may serve antimicrobial defence，但持续超过抗氧化缓冲能力后导致线粒体去极化、Cyt-C释放和caspase活化。蛋白质组学显示HPN-EVs富集LL-37、MPO、ELANE、DEFA等颗粒蛋白，并下调G6PD、FN1、ALDH1L1、SERPINB1等稳态/保护相关蛋白，提示其既递送细胞毒性介质又缺乏保护成分。LL-37可经EV递送并重现ROS放大、线粒体去极化、Cyt-C释放和caspase依赖凋亡；EV相关LL-37在较低浓度下即显示较强作用。患者HPS-EVs富含LL-37并促上皮凋亡，支持临床相关性；LL-37效应需要活H. pylori和完整肽序列，ROS为其中心介质。局限包括主要依赖体外上皮模型和有限患者队列，LL-37与其他货物协同机制尚待深入，未来需体内研究验证。

研究结论翻译：总之，HPN-EVs反映H. pylori感染期间中性粒细胞高度活化状态，作为LL-37和其他中性粒细胞来源蛋白的载体，主动驱动胃上皮功能障碍。这些囊泡诱导强烈氧化应激、线粒体去极化和凋亡，同时从根本上重塑胃上皮细胞炎症信号。尽管未全面解析单个货物成分的贡献，其协同富集支持协同促凋亡和免疫调节作用，LL-37是观察表型的重要贡献者。以AGS细胞为模型，研究人员证明中性粒细胞活化可通过EV介导的细胞间通讯转化为上皮应激。此外，在H. pylori感染患者血清中检测到富含LL-37的EVs及其促进上皮凋亡的能力，支持该通路的临床相关性。总之，这些发现将中性粒细胞来源EVs确定为连接先天免疫活化与H. pylori感染期间黏膜损伤的重要介质。尽管这些囊泡可能有助于早期抗菌防御，慢性感染期间持续产生可能促进氧化应激、上皮损伤和持续炎症，从而促进胃病理。