METTL1调控的tRF-5001b通过破坏QARS1与tRNAGln的相互作用并抑制HMGA2翻译来抑制肺腺癌

《Non-coding RNA Research》：METTL1-regulated tRF-5001b suppresses lung adenocarcinoma by impairing QARS1 interaction with tRNAGln and inhibiting HMGA2 translation

　　

背景：肺腺癌（LUAD）仍是全球癌症相关死亡的主要原因，但tRNA衍生片段（tRFs）对其进展的影响尚未被充分了解。本研究旨在探讨tRF-5001b在LUAD中的作用。方法：利用公共数据集分析tRF-5001b在LUAD组织中的表达，并通过Northern blotting进行验证。通过EdU、transwell和CCK-8实验在体外评估tRF-5001b、QARS1和HMGA2的生物学功能，并在体内采用皮下注射和静脉注射模型进行评估。采用RNA荧光原位杂交和免疫荧光确定tRF-5001b和QARS1的亚细胞定位。通过qRT-PCR和Western blotting检测METTL1、WDR4、QARS1和HMGA2的表达水平。通过RNA免疫沉淀、RNA pull-down、银染、免疫共沉淀和分子对接研究tRF-5001b与QARS1之间的相互作用。进行嘌呤霉素掺入实验以评估tRF-5001b对整体蛋白质翻译的影响。结果：tRF-5001b在LUAD组织中显著下调，并在体外和体内通过抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭表现出肿瘤抑制效应。机制上，tRF-5001b竞争性破坏QARS1与tRNA^Gln之间的相互作用，从而抑制HMGA2翻译并减弱LUAD进展。此外，METTL1被鉴定为tRF-5001b生物发生的负调控因子，其通过催化tRNA-Tyr-GTA的m⁷G修饰发挥作用。结论：本研究确定tRF-5001b通过抑制HMGA2翻译作为LUAD进展的抑制因子，并强调METTL1是其生物发生的关键调控因子。这些发现为tRF介导的分子机制提供了新见解，并为肺腺癌提出了潜在的治疗靶点。

研究背景：肺癌仍是全球死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌占临床诊断的大多数，而肺腺癌（LUAD）是最常见的组织学亚型，因其早期症状缺乏且转移率高，预后较差。尽管靶向治疗和免疫治疗的发展使肺癌发病率和死亡率逐年下降，但LUAD的临床挑战依然严峻，迫切需要鉴定参与LUAD进展的新型分子调控因子，以作为潜在的诊断生物标志物或治疗靶点。tRNA衍生片段（tRFs）是长度14-50 nt的小RNA分子，由核酸内切酶对tRNA特定位点精确切割产生，根据长度、序列和切割位点可分为tRF-5s、tRF-3s、tRF-1s和i-tRFs四类。已有研究表明tRFs参与基因转录、蛋白质翻译和表观遗传等多种分子调控机制，在LUAD中可通过miRNA样靶基因沉默或影响蛋白质稳定性和凝聚特性发挥调控功能。此外，tRFs具有翻译调控功能，但tRFs与tRNA参与翻译这一保守机制之间的关联尚不清楚，tRFs是否通过tRNA调控LUAD仍未明确。近期研究发现衰老神经元细胞来源的Glu-5′-tsRNA-CTC与亮氨酰-tRNA合成酶2（LaRs 2）形成复合物，竞争性阻碍tRNA氨酰化，这为tRFs与tRNA结构之间的潜在关联提供了直接证据。METTL1是METTL家族中较小的亚型，通过与WDR4形成甲基转移酶复合物催化部分tRNA可变环的N7-甲基鸟苷（m⁷G）修饰。m⁷G修饰有利于保护tRNA免受核酸酶降解，促进癌蛋白翻译。METTL1在LUAD中同样通过介导m⁷G修饰调控tRNA稳定性，但m⁷G修饰介导的tRNA稳定性增加是否调控tRFs生物发生尚不清楚。仅有一项研究显示METTL1缺失导致tRNA m⁷G修饰丢失，从而介导一系列具有肿瘤抑制效应的5′-tRFs的生物发生。因此，探索METTL1调控tRF生物发生的分子机制有助于揭示tRFs与亲本tRNA的具体关联。本研究鉴定了tRF-5001b，并证明其在体外和体内抑制LUAD发展。机制上，tRF-5001b通过竞争谷氨酰胺酰-tRNA合成酶1（QARS1）的tRNA结合位点，抑制其结合tRNA^Gln的功能，阻碍高迁移率族AT-hook 2（HMGA2）的翻译效率。本研究为基于tRF-5001b的LUAD临床诊断和治疗方案开发提供了有力证据。

关键技术方法：研究人员收集了云南省肿瘤医院的35对LUAD肿瘤组织及配对癌旁非肿瘤组织（经云南省肿瘤医院伦理委员会批准）。细胞系HEK-293T、A549、BEAS-2B购自ATCC或中国科学院，H1299、H1975、PC-9、H1734和H460细胞系用于实验。动物实验使用5周龄雌性SPF级BALB/c裸鼠（江苏集萃药康生物技术）。主要技术方法包括：公共数据集（TCGA、GEO中的GSE33858、GSE83527、GSE62182、GSE81089）生物信息学分析、Northern blot、RNA荧光原位杂交、核质分离、RNA pull-down结合银染和质谱分析、RNA免疫沉淀（RIP）、免疫共沉淀（Co-IP）、分子对接（AlphaFold 3和RNAComposer）、嘌呤霉素掺入实验、EdU和Transwell及CCK-8实验、皮下注射和尾静脉注射动物模型、IVIS活体成像、H&E染色和免疫组化分析。

研究结果：

3.1 tRF-5001b在LUAD中存在且表达下调：研究人员重新分析GSE33858数据集中10对LUAD肿瘤组织与配对癌旁组织的tRNA表达谱，筛选出差异最显著的5个tRNA，其中tRNA-Tyr-GTA显著下调。分析GSE83527和GSE6218两个tRF表达谱数据集，发现来源于tRNA-Tyr-GTA的tRF-5001b在两个数据集中均显著下调。IGV可视化显示多数测序reads主要分布于tRNA-Tyr-GTA的5′端，与tRF-5001b序列高度相似。tRF-5001b来源于tRNA-Tyr-GTA降解，保留tRNA 5′端，长度25 nt。由于tRF结构特殊性，茎环法不适用于tRF-5001b检测，而Add A法可特异性扩增目标片段并经Sanger测序验证序列准确性。tRF-5001b在所有LUAD细胞系中较正常肺上皮细胞BEAS-2B均不同程度下调，在35例LUAD患者癌组织中较癌旁组织显著下调。

3.2 tRF-5001b定位于细胞质并在体外抑制LUAD进展：FISH和核质分离实验证实tRF-5001b主要定位于LUAD细胞质。构建过表达tRF-5001b的细胞系，Northern blot使用tRF-5001b特异性探针验证仅tRF-5001b显著过表达。CCK-8和EdU-594实验显示过表达tRF-5001b显著抑制LUAD细胞增殖，而抑制tRF-5001b则增强细胞增殖。划痕愈合和Transwell实验表明tRF-5001b抑制LUAD细胞迁移和侵袭，抑制tRF-5001b则促进这些恶性行为。

3.3 tRF-5001b与QARS1的反密码子结合结构域相互作用：由于tRF-5001b与tRNA-Tyr-GTA序列高度重复，研究人员设计两种RNA pull-down方法避免干扰，结合质谱分析鉴定tRF-5001b结合蛋白。银染显示tRF-5001b结合蛋白种类丰富，质谱鉴定共76个蛋白，包括QARS1和NARS1。RNA pull-down和Western blot验证表明tRF-5001b与QARS1结合较NARS1更为常见。RIP实验表明QARS1可显著富集tRF-5001b。FISH和IF实验显示tRF-5001b与QARS1共定位于细胞质。AlphaFold 3预测tRF-5001b可能富集于QARS1的反密码子结合结构域。构建QARS1截短突变体（QARS1-WT、QARS1-M1、QARS1-M2），Flag-RIP实验表明全长QARS1和保留反密码子结合结构域的M1突变体显著富集tRF-5001b，而缺失反密码子结合结构域的M2突变体则无显著富集，tRNA^Gln同样富集于反密码子环结合结构域。这提示tRF-5001b可能是tRNA^Gln参与翻译的竞争者。

3.4 tRF-5001b通过竞争性抑制QARS1结合tRNA^Gln阻碍HMGA2翻译：嘌呤霉素掺入实验表明tRF-5001b显著抑制LUAD整体翻译。tRF-5001b不影响QARS1整体表达，表明其不通过影响QARS1合成或降解调控翻译。竞争实验表明tRF-5001b以浓度依赖方式显著抑制QARS1结合tRNA^Gln的能力。在A549 tRF-5001b OE细胞中过表达QARS1后进行蛋白质组学分析，鉴定出107个候选蛋白，分析其谷氨酰胺丰度并选取丰度最高的前4个蛋白。结合TCGA-LUAD和GSE81089转录组数据，4个蛋白中仅HMGA2在两个数据集的肿瘤组织中均显著高表达。qRT-PCR显示HMGA2 mRNA水平无显著差异，而Western blot显示tRF-5001b OE细胞中HMGA2蛋白水平显著下调，提示HMGA2在翻译水平受到抑制。救援实验表明tRF-5001b OE+QARS1 OE和tRF-5001b OE+HMGA2 OE均显著逆转tRF-5001b OE引起的细胞增殖、迁移和侵袭抑制。

3.5 tRF-5001b在体内抑制LUAD增殖和转移：皮下注射A549细胞构建异种移植瘤模型，过表达tRF-5001b显著抑制小鼠LUAD肿瘤生长。免疫组化显示tRF-5001b过表达肿瘤组织中增殖标志物Ki-67和迁移标志物MMP-2显著下调，HMGA2在体内同样受到抑制。尾静脉注射构建肺转移模型，IVIS活体成像显示tRF-5001b OE组发光强度持续低于NC组。H&E染色显示NC组肺组织广泛浸润性肿瘤生长，而tRF-5001b OE组大部分保留完整肺泡结构，仅少量肿瘤细胞存在。

3.6 METTL1催化tRNA-Tyr-GTA的m⁷G修饰抑制tRF-5001b生物发生：tRF-5001b是来源于tRNA-Tyr-GTA的5′-tRF。METTL1与其调控伙伴WDR4是负责部分tRNA m⁷G修饰的主要细胞甲基转移酶复合物，tRNA-Tyr-GTA已被鉴定为METTL1调控的m⁷G修饰tRNA之一。METTL1和WDR4在LUAD细胞系中均表达上调。RIP实验表明METTL1富集tRNA-Tyr-GTA且具有显著m⁷G修饰。敲低METTL1显著降低tRNA-Tyr-GTA的稳定性和表达，Northern blot显示敲低METTL1后tRF-5001b表达显著上调。敲低WDR4对tRNA-Tyr-GTA和tRF-5001b的调控功能与METTL1一致。建立野生型METTL1-Flag（METTL1-WT-Flag）和催化失活突变体METTL1-Flag（METTL1-MUT-Flag）细胞系，Flag-RIP和m⁷G-RIP显示METTL1-WT-Flag显著富集tRNA-Tyr-GTA并促进更多m⁷G修饰，而METTL1-MUT-Flag丧失此功能。METTL1-WT显著促进tRNA-Tyr-GTA的稳定性和表达效率，METTL1-WT介导的tRF-5001b下调可被tRF-5001b mimic逆转，而METTL1-MUT丧失调控tRNA-Tyr-GTA和tRF-5001b的功能。救援实验表明METTL1-WT显著促进LUAD体外增殖、迁移和侵袭，而METTL1-MUT无法发挥正常调控功能。

讨论部分总结：过去tRFs被认为是tRNA代谢后的降解片段，其生物学功能鲜有认识。近期研究揭示多种tRFs在LUAD生物学过程中发挥重要作用，主要通过影响转录调控控制LUAD发展。本研究首次证明tRF-5001b在LUAD中真实存在，并首次展示tRF在翻译水平抑制LUAD进展。tRF-5001b在LUAD患者癌组织中显著下调，体内外功能实验证明其抑制LUAD增殖和侵袭，具有开发为对抗LUAD进展的小分子药物的潜力。tRFs的生物发生对揭示其功能至关重要，核酸内切酶如Dicer、Angiogenin（ANG）和RNase2是tRF产生的关键，早期研究提示tRNA修饰可影响tRF生物发生效率。本研究发现METTL1/WDR4介导的m⁷G修饰增强tRNA-Tyr-GTA稳定性并抑制tRF-5001b生物发生。然而其他机制也可能参与调控tRF-5001b生物发生。值得注意的是METTL1/WDR4催化特定全长tRNA的m⁷G46修饰，而tRF-5001b是不含经典G46修饰位点的5′-tRF。此外tRNA^Gln已被实验证明为非m⁷G修饰tRNA，不受METTL1/WDR4扰动的显著影响。因此目前无直接证据表明METTL1/WDR4修饰tRF-5001b本身或tRNA^Gln。tRFs的功能潜力似乎与其保留亲本tRNA部分复杂结构的能力相关，这种独特特征使其能够执行多种生物学功能。本研究发现tRF-5001b因与tRNA序列相似，能够占据QARS1上tRNA^Gln的结合位点，阻止QARS1与tRNA^Gln结合，从而阻碍翻译进程。通过蛋白质组学分析鉴定HMGA2为tRF-5001b的潜在下游靶点，HMGA2是已知的染色质相关致癌因子，在LUAD中频繁上调且高表达与不良预后相关，促进肺癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化（EMT）。救援实验证明过表达QARS1或HMGA2均可逆转tRF-5001b对LUAD细胞增殖和侵袭的抑制作用。然而研究人员指出尚缺乏核糖体水平的直接证据，无法明确证明HMGA2翻译效率的降低。鉴于tRF-5001b在肿瘤中低表达及其潜在肿瘤抑制效应，其有望成为LUAD新的诊断标志物和治疗靶点。

研究结论翻译：研究人员的发现表明，受METTL1/WDR4调控的tRF-5001b通过竞争性阻碍QARS1与tRNA^Gln的结合，从而抑制HMGA2翻译，在抑制LUAD进展中发挥关键作用。这一发现首次证明tRF在LUAD中于翻译水平发挥肿瘤抑制效应。本研究为tRFs的抗肿瘤功效提供了新的机制见解，为LUAD的早期诊断和治疗提供了新策略。