阳离子残基性质对Lynronne家族抗菌肽活性的影响

《Journal of Peptide Science》：Influence of the Nature of the Cationic Residues on the Activity of the Antimicrobial Peptides of the Lynronne Family

　　

大多数抗菌肽（antimicrobial peptides, AMPs）为阳离子性，其带正电荷的氨基酸残基（即精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸）负责与细菌的选择性相互作用。本研究以Lynronnes肽为模型，考察了阳离子残基性质的影响。研究人员设计并合成了替换现有阳离子残基类型的衍生物。所有衍生物及亲本肽均在二级结构、抗菌活性、抗生物膜活性、作用机制和体外毒性方面进行了研究。全组氨酸（His）肽无活性，而全赖氨酸（Lys）变体对革兰氏阴性菌株表现出最高效力，尤其是对大肠杆菌（E. coli）。全精氨酸（Arg）类似物对革兰氏阳性菌株活性更强，在盐或血清条件下稳定性增强，但溶血性也更高。机制研究表明，这些肽通过膜通透化发挥作用。最后，Lynronne-3及其全Lys衍生物在预防和根除生物膜方面均被证明最为有效。这些发现证实，AMPs中存在的阳离子残基类型影响其活性、毒性及对宿主因素的敏感性，其效应取决于其余氨基酸序列，Lys取代成为针对大肠杆菌的Lynronnes的一种有前景的策略。

研究背景方面，抗生素自1910年Salvarsan问世及1928年Fleming发现青霉素以来经历了黄金时代，但抗生素过度使用（动物使用约占70%）产生的选择性压力促进了耐药变体的生存与传播，同时新抗生素发现和上市数量持续下降。多数耐药感染源自ESKAPE组细菌（常扩展为ESKAPEE以包括E. coli），该组涵盖革兰氏阳性与阴性菌，常导致医院获得性感染，在免疫受损和重症监护患者中可能致命。此外，炭疽芽孢杆菌、鼻疽伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、土拉弗朗西斯菌和鼠疫耶尔森菌被列为美国一级精选剂，开发针对这些物种的新型抗菌化合物具有治疗自然感染和应对生物威胁的双重意义。抗菌肽作为先天免疫的支柱，存在于几乎所有生物体中，其多因素机制（主要为膜溶解性）限制了耐药性的产生，因而重新受到关注。大多数AMPs长10–60个氨基酸，具有适度疏水性（约40%）和两亲性，富含精氨酸（Arg）、赖氨酸（Lys）和组氨酸（His）等碱性残基。AMPs的阳离子性质（+2至+9）决定其与阴离子细菌表面的静电相互作用，引起快速溶菌效应。然而，除净电荷外，碱性侧链的化学性质和分布是肽-膜相互作用及抗菌活性的关键决定因素。Arg的胍基可形成双齿氢键，与脂质双层的相互作用强于Lys的伯铵基团，可能导致抗菌活性增加但也可能增加溶血或细胞毒性；His的咪唑侧链质子化依赖pH（pKa≈6），使富含His的肽能根据局部环境在活性和非活性状态间切换。阳离子残基取代效应具有序列特异性而非普遍可预测，因此需要在确定的肽支架内评估阳离子残基取代。Lynronne-1、Lynronne-2和Lynronne-3是通过瘤胃微生物基因组文库宏基因组筛选鉴定的三种AMPs，为19–20个氨基酸的肽，在阴离子脂质存在下呈两亲性螺旋构象，净电荷分别为+6、+5和+6，疏水性约40%。Lynronnes对多种ESKAPEE病原体表现出显著活性，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和多重耐药铜绿假单胞菌，能快速降低细菌种群并抑制生物膜形成，同时表现出低溶血性和有限细胞毒性。机制研究表明Lynronnes靶向细菌膜，产生快速溶菌效应。局部给药Lynronne-1（10% w/v）在小鼠MRSA皮肤感染模型中使细菌载量降低99%；Lynronne-1（32 mg/kg）和Lynronne-2（128 mg/kg）在Galleria mellonella幼虫模型中提供对铜绿假单胞菌PAO1感染的完全保护。在此背景下，本研究所研究的Lynronnes衍生物构成了探索Arg、Lys和His阳离子残基的性质、排列和比例如何调节AMPs活性、毒性、选择性和抗生物膜活性的合理框架。

研究人员开展了以下研究并得出相应结论：通过标准Fmoc固相肽合成（SPPS）合成了13种肽（亲本肽及其衍生物），经ESI-MS确认身份，分析型RP-HPLC显示所有终产物纯度高于95%。研究结论表明，Lynronnes肽中阳离子残基的系统取代以序列依赖方式调节其结构、抗菌活性、选择性和安全性特征。全Arg变体具有改善的抗菌活性和盐耐受性，但常被增加的溶血毒性所抵消；全Lys衍生物通常在抗菌效力与选择性之间提供最佳平衡，尤其对E. coli；全His肽尽管无毒性但缺乏抗菌活性，表明生理pH下阳离子电荷的丧失损害了抗菌活性同时限制了毒性。对多种生物威胁剂和分枝杆菌的活性虽 modest 但进一步证明了这些肽在医学中的潜力。盐或血清条件下效力的丧失以及亚抑菌浓度下生物膜形成的促进确定了重要的优化领域。这些发现为Lynronnes衍生肽的未来设计建立了合理框架，并确定Lys取代为提高抗菌活性与安全性平衡的特别有前景的策略。

研究人员用到的主要关键技术方法包括：采用标准Fmoc固相肽合成化学在Rink酰胺MBHA树脂上合成肽，手动合成使用HATU为缩合剂、DIPEA为碱，自动合成在Biotage Initiator+ Alstra肽合成仪上使用HBTU和DIPEA；用 preparative RP-HPLC纯化、分析型RP-HPLC分析纯度，SYNAPT G2 HDMS质谱仪以正电喷雾模式测定分子量；远紫外圆二色（CD）光谱（185–270 nm）在磷酸缓冲液（pH 7.4）中、无或有20 mM SDS胶束条件下记录，用ChiraKit及SELCON3或SELCON2分析二级结构含量；采用肉汤微量稀释法测定最低抑菌浓度（MIC），针对BSL-2 ESKAPEE菌株参照EUCAST程序、针对BSL-3菌株参照CLSI建议、针对分枝杆菌采用resazurin微量滴定 assay（REMA）；细胞毒性用resazurin法在四种人细胞系（BEAS-2B、Caco-2、HaCaT、HepG2）上测定CC50，溶血活性用人红细胞测定HC50；膜通透化通过荧光素/荧光素酶生物发光 assay 测定ATP释放；抗生物膜活性用结晶紫 assay 在S. aureus ATCC 6538和E. coli LF82上测定生物膜抑制和根除。样本队列来源方面，ESKAPEE参考菌株来自ATCC，致病性和临床E. coli菌株包括EPEC和EHEC由Prof Brendan Kenny（Bristol University, United Kingdom）提供、 adherent-invasive E. coli参考菌株LF82由Eric Oswald（IRSD, Toulouse, France）提供、产ESBL的阿莫西林耐药尿路致病分离株UPEC CF1702（DSM 22334, DSMZ, Braunschweig, Germany）；BSL-3生物威胁剂包括Bacillus anthracis Ames、Burkholderia pseudomallei K96243、Burkholderia mallei ATCC 23344、Brucella melitensis（NR-256）、Francisella tularensis（NR-643）和Yersinia pestis（NR-641），在IRBA（Brétigny-sur-Orge, France）BSL-3条件下处理；分枝杆菌菌株包括Mycobacterium abscessus CIP104536T光滑（S）或粗糙（R）形态型、Mycobacterium marinum ATCC BAA-535/M和无毒M. tuberculosis mc26230参考菌株。

研究结果方面：3.1 肽设计与合成——对每种Lynronne（1–3），通过将天然阳离子残基替换为全Arg、全Lys、反向Arg-Lys（"Inv"衍生物）和全His设计衍生物；Lynronne-3天然序列仅含Arg，故仅生成两种衍生物（全Lys和全His）。共合成13种肽，ESI-MS确认身份，RP-HPLC纯度均高于95%。3.2 结构研究——在磷酸缓冲液中CD光谱表明Lynronnes衍生物主要为无规卷曲，在阴离子SDS胶束存在下α-螺旋含量显著增加，出现约208和222 nm的特征双最小值。亲本肽中Lynronne-1在SDS存在下螺旋倾向最高（80.2%），其次Lynronne-2（77.0%），Lynronne-3显著较低（33.7%）。阳离子残基取代改变α-螺旋百分比但保持整体螺旋折叠，例如Lynronne-1Inv仅Arg和Lys位置反转，螺旋度47.4%相比亲本80.2%；Lynronne-2R螺旋度43.2%相比亲本77.0%；Lynronne-3K螺旋度46.0%相比亲本33.7%。三个Lynronnes支架间未出现一致趋势，表明每种取代效应取决于特定序列背景。3.3 抗菌活性——全His变体对所有测试菌株在高达500 μg/mL浓度下无活性；E. coli最敏感，Lynronne-2K的MIC（0.98 μg/mL）比亲本Lynronne-2（7.81 μg/mL）低8倍；对革兰氏阳性菌，Lynronne-2R变体相对Lynronne-2活性改善；但阳离子残基取代效应强烈菌株依赖和序列特异，初始结果无法在所有支架间建立一致趋势。对四种致病或耐药E. coli分离株（EPEC、EHEC、LF82、UPEC CF1702），除全His变体外所有肽显示良好活性，MIC范围0.98–62.50 μg/mL，Lynronne-1K对全部四株达到MIC 0.98 μg/mL；三个Lynronnes支架中全Lys变体一致显示相对亲本改善的活性，表明Lys残基可能特别有利于抗E. coli活性。对生物威胁剂 panel，肽表现出物种依赖性抗菌活性，MIC范围31.25至>250 μg/mL；对B. anthracis活性最大且最一致，尤其Lynronne-1衍生肽除全His变体外均达到MIC 31.25 μg/mL；无肽抑制B. mallei或B. pseudomallei生长；革兰氏阴性种中抗菌活性限于部分肽，Lynronne-1R对B. melitensis、F. tularensis和Y. pestis显示相对亲本增强活性；全His变体对所有生物威胁剂无活性。对分枝杆菌，Lynronne-1显示最广但中等的活性，对M. tuberculosis MIC最低（291±19 μg/mL）；Lynronne-1R对M. tuberculosis效力提高1.6倍（179±3 μg/mL）；Lynronne-1和Lynronne-1K是唯一对M. abscessus和M. marinum有活性的肽，Lynronne-1K的MIC分别为717±20 μg/mL和552±52 μg/mL；全His和反向衍生物活性消除或降低；全Arg衍生物成为提高抗菌效力最有效的修饰，尤其对M. tuberculosis。盐和血清条件下，多数衍生物在高盐条件下抗菌活性降低，全Lys变体最盐敏感，MIC增加16–500倍，例如Lynronne-2K对E. coli的MIC在每种盐存在下增加500倍（从0.98至500 μg/mL），而亲本Lynronne-2增加32倍（从7.81至250 μg/mL）；全Arg衍生物一般受盐补充影响较小，Lynronne-1R对E. coli MIC仅增加8倍，在盐存在下对S. aureus甚至显示更好活性（从15.62至7.81 μg/mL）；Lynronne-3支架为例外，全Lys变体Lynronne-3K在MgCl2和CaCl2存在下对S. aureus保持比全Arg对应物更大活性。50%人血清孵育4 h后，对S. aureus多数衍生物保持与MH培养基中相当的活性，但Lynronne-2衍生物受影响最大，Lynronne-2R失去所有可检测活性（MIC从31.25至>500 μg/mL）；对E. coli MIC一般加倍，Lynronne-3衍生物有时增加达4倍；尽管血清诱导活性降低，全Lys衍生物仍是对E. coli最活跃的化合物，Lynronne-1K和Lynronne-3K在血清存在下MIC甚至更低。3.4 细胞毒性——亲本Lynronne-1、Lynronne-2和Lynronne-3显示有限细胞毒性，CC50范围分别为153–517 μg/mL、604至>1000 μg/mL、560至>1000 μg/mL；Lynronne-1所有衍生物相对亲本显示降低或不变的细胞毒性；Lynronne-2的全Arg变体显示增加毒性；Lynronne-3的全Lys变体比亲本毒性更高；所有含His变体在最高测试浓度（>1000 μg/mL）下无毒。溶血活性方面，亲本Lynronne-1和Lynronne-3及其衍生物比Lynronne-2及其衍生物更具溶血性；全Arg衍生物倾向于比全Lys或全His对应物 exhibit 更高溶血活性。选择性指数（SI）方面，全Arg衍生物显示与亲本肽相当的SI范围，全Lys衍生物更具选择性且SI更高，除Lynronne-3及其全Lys衍生物获得相似SI值外。3.5 作用机制——通过荧光素/荧光素酶生物发光 assay 测量ATP释放评估膜完整性影响；对S. aureus，所有肽诱导非常快速的膜裂解，在孵育第一分钟内达到100% ATP释放，仅Lynronne-2R和Lynronne-2K作用较慢，在暴露3分钟后达到最大膜通透化；对E. coli，膜通透化较慢且效率较低，除Lynronne-2K和Lynronne-2Inv外所有Lynronnes衍生物最大通透化在20分钟内达到阳性对照的60%–70%，符合孔形成机制导致部分膜破坏，Lynronne-2K和Lynronne-2Inv显示较慢动力学，需约60分钟达到相似ATP释放水平。3.6 抗生物膜活性——用S. aureus ATCC 6538和adherent-invasive E. coli LF82作为模型，通过结晶紫 assay 定量生物膜生物量；首先在初始OD600为0.05下测定改良MIC（MIC*），MIC*值高于标准MIC，增加范围2–32倍；除全His衍生物外，对浮游S. aureus无活性的Lynronne-2K和Lynronne-2Inv被排除在后续该菌株生物膜 assay 外。所有活性肽在低至0.125× MIC*浓度下预防两种菌株生物膜形成；对S. aureus，Lynronne-3和Lynronne-3K显示最强预防效果，生物膜生物量减少85%，而Lynronne-2在相同条件下仅38%抑制；对E. coli，Lynronne-2K最有效，在0.125× MIC*下生物量减少65%。抗生物膜活性浓度依赖但非单调，Lynronne-2和Lynronne-2R对S. aureus在0.5× MIC*下生物量达未处理对照的200%；E. coli中Lynronne-2K在0.125× MIC*下减少生物膜形成65%，但浓度增至0.25× MIC*时抑制 unexpectedly 降至仅14%；总体双相特征表明某些肽特定亚MIC*浓度可能 paradoxical 促进生物膜形成，而较低浓度保持有效抑制。根除 established 生物膜需要比预防更高肽浓度，所有活性肽在MIC*至4× MIC*浓度范围内减少预形成生物膜；Lynronne-3总体最有效，对S. aureus和E. coli在4× MIC*下生物膜生物量分别减少92%和74%，在MIC*下分别减少54%和52%；对S. aureus，Lynronne-2和Lynronne-2R显示最弱活性，4× MIC*下仅30%减少；对E. coli，Lynronne-1K效力最低，4× MIC*和MIC*下分别仅44%和8%减少。

讨论部分总结：自发现以来抗生素拯救了数百万生命并彻底改变医学，但多重耐药菌的复燃威胁这一黄金时代，重新激发了对AMPs等替代策略的兴趣。本研究通过系统改变阳离子残基（Arg、Lys或His）生成了先前描述的Lynronne-1、Lynronne-2和Lynronne-3肽的衍生物，共设计合成13种肽。CD光谱分析显示所有Lynronnes衍生物在水性缓冲液中无序，在SDS胶束存在下采用典型α-螺旋构象，支持这些肽在膜相互作用时折叠的模型。用其他碱性氨基酸取代天然阳离子残基影响螺旋含量，但三个支架间未出现普遍趋势；Lynronne-1Inv显示降低的螺旋度（47%）相比亲本（80%）但保留或略微改善抗菌活性且毒性降低；Lynronne-2R从77%降至43%螺旋；Lynronne-3显示最低螺旋含量（34%）和最低抗菌活性（对E. coli MIC=31.25 μg/mL），表明最低螺旋倾向可能有助于活性，但螺旋度与抗菌活性关系并非直接。全His变体无活性与生理pH下该残基阳离子电荷丧失一致；E. coli最敏感，全Lys变体显示最大效力，Lynronne-2K对E. coli ATCC 8739的MIC比亲本改善8倍（0.98 vs 7.81 μg/mL）；对革兰氏阳性菌全Arg变体倾向于比Lys取代对应物更有活性；阳离子残基取代影响菌株和支架依赖，无普遍规则。对四种致病或耐药E. coli分离株，全Lys变体再次显示优异活性，Lynronne-1K对全部四株达到MIC 0.98 μg/mL，与参考菌株观察到的活性匹配，表明富含Lys变体可能特别有利于靶向E. coli包括致病和/或耐药分离株。对BSL-3生物威胁剂，抗菌活性更受限且强烈物种特异，对革兰氏阴性剂有限活性可能部分反映病原体特异性细胞包膜适应降低对阳离子AMPs的敏感性，包括LPS/脂质A重塑、表面电荷改变和外膜通透性降低；对B. anthracis观察到最有效活性尤其Lynronne-1衍生肽；对B. mallei或B. pseudomallei在最高测试浓度下未检测到活性；对B. melitensis、F. tularensis和Y. pestis活性限于 selected 化合物，Lynronne-1R显示最广谱。对三种分枝杆菌病原菌株，全Arg衍生物显示增强抗菌效力尤其对M. tuberculosis mc26230，全Lys肽对M. abscessus和M. marinum保留部分活性，全His和反向肽显示一致减弱或消除活性，强调阳离子残基身份在调节跨分枝杆菌物种效力中的关键作用。后续深入表征选择E. coli和S. aureus作为代表性革兰氏阴性和阳性模型菌株，评估盐和血清暴露下肽性能并研究膜通透化和抗生物膜活性。盐耐受性高度依赖阳离子残基性质和肽支架，富含Arg变体一般显示优于Lys取代对应物的盐耐受性，与Arg胍基与膜磷酸盐形成更强静电相互作用的能力一致，但该趋势并非普遍，Lynronne-3K显示比其全Arg肽更好的盐耐受性，强调该性质的支架依赖性。血清稳定性方面所有衍生物对S. aureus保留可观活性，Lynronne-2变体受影响最大，全Arg肽Lynronne-2R失去所有可检测活性（>500 μg/mL）；对E. coli血清诱导活性损失一般较不明显，MIC仅增加2–4倍，尽管降低，全Lys衍生物在血清条件下一致保持对E. coli最活跃，加强其进一步开发潜力。选择性方面，多数Lynronne-1衍生物显示相对亲本对E. coli和S. aureus改善的选择性，由于降低的细胞毒性；Lynronne-2的全Arg变体比亲本毒性更高降低其选择性；Lynronne-3的全Lys变体显示增加毒性但未转化为改善的选择性；全His变体高达1000 μg/mL无毒但其无毒受限于缺乏抗菌活性；Arg取代变体倾向于比Lys取代对应物 exhibit 更高溶血活性；SI范围从11至>1020，最佳为Lynronne-2K对E. coli SI>1020，从1.7至119最佳为Lynronne-1K对S. aureus SI=19–119。除阳离子残基性质和数量外，阳离子电荷与疏水性之间的平衡是抗菌效力和对真核细胞细胞毒性的主要决定因素，最佳两亲平衡允许肽通过静电相互作用结合阴离子细菌膜同时保留足够疏水性插入膜核心；过度疏水性促进与两性离子真核膜的非选择性相互作用增加溶血和细胞毒性，而疏水性不足损害膜插入降低抗菌活性；Lynronne衍生物中全Arg变体比Lys对应物更疏水倾向于 exhibit 更高溶血活性，与Arg含量和真核膜破坏之间的既定相关性一致；全His变体在生理pH下失去阳离子特征 exhibit 既无毒性也无抗菌活性，说明需要共同优化电荷和疏水性而非独立最大化；这些观察与"两亲平衡"概念一致。与许多靶向细胞内过程的传统抗生素不同，AMPs一般通过破坏细菌膜作用诱导快速细胞死亡，这种膜中心机制被认为解释了对AMPs耐药性的罕见性；所有Lynronnes衍生物诱导ATP泄漏确认膜通透化；S. aureus中所有衍生物在接触1分钟内引起快速完全膜破坏，除Lynronne-2R和Lynronne-2K需3分钟达到此效果；E. coli中膜通透化较慢，最大ATP释放在暴露3–10分钟后观察到；Lynronne-2变体Lynronne-2K和Lynronne-2Inv显示显著延迟，需约45分钟达到最大ATP释放；值得注意的是这两个慢通透化变体也对E. coli exhibit 最强抗菌活性（MIC分别为0.98和1.95 μg/mL）；尽管革兰氏阴性菌中AMPs的较慢孔形成活性经典观察到，这种通透化动力学与抗菌效力之间的有趣分离表明 distinct 机制与膜通透化无关，如先前对亲本Lynronne-2所推测。生物膜是嵌入自身产生的胞外聚合物基质（主要为胞外多糖、胞外DNA和蛋白质）的表面附着细菌群落，其降低的抗微生物敏感性是主要临床关注，许多AMPs被报道作用于生物膜形成和 established 生物膜；肽的抗生物膜活性观察到显著二分法：成熟生物膜的根除在S. aureus和E. coli中均剂量依赖；相比之下生物膜形成的抑制在两种物种中均非单调，在中间亚MIC浓度下生物量超过较低浓度测量值，对S. aureus中Lynronne-2和Lynronne-2R甚至超过未处理对照；亚抑制刺激生物膜形成已被记录用于传统抗生素包括E. coli和MRSA中的氟喹诺酮类和E. coli中的叶酸途径抑制剂；根除 assay 中观察到的线性特征表明该双相效应不是假象而是真实生物现象；研究人员假设这种促生物膜反应特异于早期粘附阶段，其中代谢活跃的细菌细胞将亚MIC浓度感知为亚致死应激，触发包膜应激信号通路和胞外基质过度产生；亚致死AMP暴露已被显示通过基质相关决定因素启动E. coli toward 耐受和持续；铜绿假单胞菌中亚MIC抗生素通过OprF依赖途径诱导生物膜形成提高细胞内c-di-GMP，E. coli中已提出类似OmpA依赖途径；在S. aureus和E. coli中均观察到该双相效应表明它可能在革兰氏阳性和阴性菌中保守，可能涉及 distinct 但功能类似的应激反应通路；成熟生物膜中未观察到非单调特征可能因为降低的代谢活性限制可诱导应激信号，使直接膜活性成为主要作用模式；该 assay 中所有活性肽剂量依赖减少预形成生物膜，Lynronne-3在两种物种中最有效；两个 assay 之间的对比表明目标种群的生理状态——活跃粘附 versus 固着成熟——是肽暴露结果的主要决定因素；因此在AMP开发中应系统表征亚MIC暴露窗口，因为次优浓度可能有利于表面定植而非抑制；该效应 magnitude 在肽和菌株间变化表明它不是统一反应而是序列和菌株依赖的考虑，可通过仔细剂量优化和候选选择解决；结果强调考虑AMPs临床使用时仔细剂量优化的重要性，因为过低浓度可能 paradoxical 有利于持续而非抑制；该效应 magnitude 在肽和菌株间变化表明未来治疗开发应包括系统亚MIC分析以识别和避免促生物膜浓度窗口。

研究结论部分翻译：尽管需要进一步的体内研究来评估，总体而言，本研究表明Lynronnes肽中阳离子残基的系统取代以序列依赖方式调节其结构、抗菌活性、选择性和安全性特征。全Arg变体具有改善的抗菌活性和盐耐受性，但这一优势常被增加的溶血毒性所抵消，而全Lys衍生物通常在抗菌效力与选择性之间提供最佳平衡，尤其对E. coli。相比之下，全His肽尽管无毒性但缺乏抗菌活性，强调生理pH下阳离子电荷的丧失损害抗菌活性同时限制毒性。对多种生物威胁剂和分枝杆菌的活性虽 modest 但进一步证明这些肽在医学中的潜力。盐或血清条件下效力的丧失以及亚抑菌浓度下生物膜形成的促进确定了重要的优化领域。总体而言，这些发现为Lynronnes衍生肽的未来设计建立了合理框架，并确定Lys取代为提高抗菌活性与安全性平衡的特别有前景的策略。