通过基于钙的纳米调节剂，在难治性三阴性乳腺癌（TNBC）中协调代谢阻断和免疫重编程过程

《Nano Today》：Orchestrating a metabolic blockade and immune reprogramming in refractory TNBC via calcium-based nanomodulator

　　

摘要

三阴性乳腺癌（TNBC）仍然是最具致命性的乳腺癌亚型，其致病原因在于代谢可塑性、免疫抑制性的肿瘤微环境（TIME）以及强烈的转移倾向，这些因素无法通过传统的单一模式治疗策略同时得到解决。本文开发了一种新型的叶酸功能化、对肿瘤微环境响应的过氧化钙纳米平台（CHF-SHK），该平台负载有紫素（SHK），能够实现双重代谢阻断、肿瘤特异性钙化及免疫重塑，从而精准治疗TNBC。具体而言，CHF-SHK能够在酸性和谷胱甘肽富集的肿瘤微环境中智能地、选择性释放Ca²⁺和SHK。释放的Ca²⁺不仅能够诱导肿瘤细胞钙化以抑制转移，还能通过引起钙过载来破坏线粒体氧化磷酸化过程。同时，释放的SHK通过抑制PKM2有效阻断肿瘤糖酵解。这种对线粒体呼吸和糖酵解的双重抑制严重扰乱了肿瘤的能量代谢，减少了免疫抑制性的乳酸积累，并协同诱导肿瘤细胞凋亡。此外，这种代谢压力还伴随着免疫原性细胞死亡（ICD）相关信号，有助于重塑肿瘤微环境并激活全身性的抗肿瘤免疫反应。在携带4T1肿瘤的小鼠模型中，CHF-SHK表现出强烈的原发肿瘤抑制效果，并几乎完全消除了自发性肺转移，且具有良好的生物相容性。总体而言，本研究提出了一种基于单一纳米平台的独特抗代谢、抗转移和免疫治疗策略，为对抗晚期转移性TNBC提供了一种可靠且具有转化潜力的方法。

引言

乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的主要原因[1],[2]。三阴性乳腺癌（TNBC）占所有乳腺癌病例的15–20%，其特征是缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）的表达。由于其侵袭性强且缺乏分子靶点，TNBC仍是致命性最高的乳腺癌亚型[3],[4]。目前TNBC的一线治疗仍主要依赖于传统化疗，但其临床效果受到高药物耐药性、严重的脱靶毒性和不良长期预后的严重限制[5],[6]。此外，远处转移，尤其是肺部转移，导致了超过90%的TNBC相关死亡[7]。越来越多的证据表明，TNBC的进展和治疗耐药性是由三个核心因素的相互作用共同驱动的：代谢可塑性、免疫抑制性的肿瘤微环境（TIME）和高度侵袭性的转移表型。其中，内在的代谢可塑性使肿瘤细胞能够承受治疗压力并维持生存，同时促进乳酸积累和免疫抑制信号的产生，从而削弱抗肿瘤免疫，进而促进肿瘤侵袭和远处转移[8],[9],[10]。这些因素共同形成了一个自我强化的致病网络，加速了疾病进展并限制了治疗效果。然而，目前大多数治疗策略仅针对其中一个因素，未能打破它们之间的协同作用，导致临床效果有限[11]。因此，开发一种多模式治疗策略以同时干扰这些协同驱动因素对于晚期转移性TNBC具有重要意义[12],[13]。

在这些相互关联的因素中，代谢可塑性被广泛认为是TNBC进展、治疗耐药性和转移级联反应的上游核心驱动因素[14],[15],[16]。与正常组织细胞不同，肿瘤细胞会经历广泛的代谢重编程以满足其不受控制的增殖所需的生物能量和生物合成需求。这种现象被称为Warburg效应，其特征是在常氧条件下仍进行高度活跃的糖酵解，是TNBC的关键代谢特征[17],[18]。丙酮酸激酶M2（PKM2）是糖酵解的限速酶，在TNBC中通常上调，它是促进糖酵解加剧、不受控制增殖和化疗耐药性的关键驱动因素[19],[20]。因此，靶向PKM2是一种合理的代谢干预策略，例如紫素（SHK），作为一种强效的PKM2抑制剂，在临床前TNBC模型中显示出初步的抗肿瘤效果[21]。然而，单独抑制糖酵解往往效果不足，因为肿瘤细胞可以通过转向线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）来维持能量生产和细胞存活[22],[23]。这种代谢可塑性使肿瘤细胞能够从单一途径的代谢抑制中逃脱[24]，强调了同时靶向糖酵解和OXPHOS的必要性，以有效克服TNBC的这种适应性代谢抵抗。

值得注意的是，TNBC细胞中的代谢失调进一步加剧了肿瘤微环境（TME）的免疫抑制状态[25]。由有氧糖酵解驱动的乳酸积累直接损害效应T细胞功能，促进M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAM）极化，从而导致免疫学上“冷”的TME，表现为免疫细胞浸润减少和抗肿瘤反应受损[26],[27]。尽管同时阻断糖酵解和氧化磷酸化可以通过降低乳酸水平来缓解免疫抑制，但这一策略本身不足以完全重塑肿瘤微环境[28],[29]。这一限制主要源于其无法克服TNBC细胞本身较低的免疫原性[30],[31]。免疫原性细胞死亡（ICD）相关的信号可能通过帮助克服这一限制而起到重要作用[32]。ICD通过释放损伤相关分子模式（DAMPs），包括钙网蛋白、ATP和HMGB1，激活抗原呈递细胞并触发肿瘤特异性适应性免疫反应[33],[34]。通过这种方式，ICD精确地弥补了代谢阻断的局限性，直接增强了TNBC的免疫原性，最终将“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤。

鉴于代谢重编程与免疫逃逸之间的相互作用，一种能够同时干扰肿瘤代谢并诱导ICD的治疗策略具有巨大潜力。基于过氧化钙（CaO₂）的纳米材料是多功能、对肿瘤微环境响应的平台。在酸性的肿瘤微环境中，这种纳米平台会分解并释放钙离子（Ca²⁺，从而引发线粒体功能障碍并抑制OXPHOS[35],[36]。通过与靶向PKM2的糖酵解抑制剂SHK结合，这种基于CaO₂的纳米平台实现了对糖酵解和OXPHOS的双重阻断，从而克服了TNBC细胞的代谢韧性。此外，叶酸（FA）受体在TNBC细胞上高度表达，这使得FA修饰成为增强肿瘤特异性积累的有效策略。这种靶向策略进一步驱动钙离子在肿瘤病灶中的富集，导致膜钙化，从而直接抑制肿瘤侵袭和转移定植[37],[38]。

基于这些考虑，我们合理设计了一种叶酸功能化的、对肿瘤微环境响应的基于CaO₂的纳米平台（称为CHF-SHK）（方案1），该平台能够主动靶向肿瘤区域，并在酸性和谷胱甘肽丰富的微环境中智能释放Ca²⁺和SHK。释放的Ca²⁺促进膜钙化，阻碍肿瘤细胞迁移并同时破坏线粒体功能以抑制OXPHOS，而SHK通过抑制PKM2阻断糖酵解。通过这种双重代谢干预，CHF-SHK能够有效破坏肿瘤的代谢可塑性，引发能量危机并促进ICD相关免疫信号的释放，从而逆转免疫抑制并激活全身性的抗肿瘤免疫。与那些仅针对单一代谢途径或依赖钙基成分干预的策略不同，这项工作在一个对肿瘤微环境响应的平台上同时解决了代谢可塑性、免疫抑制和转移进展问题，为晚期转移性TNBC提供了有前景的治疗范式。

章节片段

CHF-SHK的合成与表征

CHF-SHK的合成方案如图1所示，包括生物矿化和药物装载的顺序过程。根据透射电子显微镜（TEM）图像（图1A），所得到的CHF-SHK表现出均匀的球形形态，粒径更小，分散性更好，优于CHF（CaO₂-HSA-FA）。具体而言，CHF-SHK和CHF的动态直径分别为213.7纳米和248.1纳米（图1B，图S1）。zeta电位...

结论

TNBC的特点是显著的代谢可塑性、免疫抑制性的肿瘤微环境（TIME）和高侵袭性，这些因素共同推动了肿瘤的侵袭性和远处转移。为应对这些挑战，我们开发了一种叶酸功能化的白蛋白/过氧化钙纳米平台（CHF-SHK），该平台负载有SHK，实现了代谢调节和肿瘤微环境重塑的多模式协同治疗。这一平台具有主动靶向等多种功能...

材料

人血清白蛋白（HSA，≥98%）、叶酸（FA）、氯化钙、聚乙烯吡咯烷酮（PVP K30）、氨溶液和紫素购自中国医药化学试剂有限公司。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）、钙黄素-AM、碘化丙啶（PI）、钙离子检测试剂盒（Fluo-4AM）、活性氧物种检测试剂盒（ROS Assay Kit）、凋亡检测试剂盒（Annexin V-FITC）、成骨细胞矿化结节染色试剂盒（Alizarin Red S Staining Kit for Osteogenesis）、细胞内pH检测...

统计分析

所有结果至少重复了3次。统计分析使用GraphPad Prism 7.0进行，结果以均值±标准差（SD）表示。两组间差异的统计显著性通过独立的检验确定。所有测试在p值*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001时被认为是统计学上显著的。

CRediT作者贡献声明

Mingliang Ning：撰写——原始草案、正式分析、数据管理、概念构想。Ziyi Cheng：方法学、正式分析。Yutong Zhu：撰写——审稿与编辑、方法学、正式分析、数据管理。Bicheng Han：方法学、正式分析。Xi Deng：方法学、数据管理。Hangrong Chen：撰写——审稿与编辑、监督、资金筹集。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了上海国际合作项目（编号23490712900）和中国科学院战略性优先研究计划（编号XDB1900000）的支持。所有动物实验均得到了同济大学实验动物中心的批准，动物生物医学研究授权号为SHDSYY-2023-P0055。部分插图组件来自BioRender（www.biorender.com)，用于模型绘制。

Mingliang Ning|Ziyi Cheng|Yutong Zhu|Bicheng Han|Xi Deng|Hangrong Chen