分泌型母亲乳汁喂养婴儿的肠道菌群以性别依赖方式影响小鼠肠道动力及肠神经系统发育

《Neurogastroenterology & Motility》：Microbiota From Human Infants Consuming Secretors Mothers' Milk Affects Murine Intestinal Motility and Enteric Nervous System Development in a Sex-Dependent Manner

　　

背景：生命早期是肠道微生物组与肠神经系统（ENS）共同发育的关键时期，二者协同塑造远期胃肠道（GI）功能。人乳喂养及尤其母体分泌型（secretor）表型强烈影响早期微生物组组成。然而，人乳促进的微生物组如何影响ENS发育仍 largely 未知。方法：将3周龄雄性和雌性C57BL/6无菌（germ-free）小鼠定植来自母体为分泌型（SMM，乳汁含2-岩藻糖基乳糖）或非分泌型（NSM）母亲的婴儿，或来自食用牛乳配方奶粉婴儿（MFM）的粪便微生物群。未移植的雄性和雌性无菌小鼠作为对照。于出生后第35–37天评估GI转运。采用免疫组化和共聚焦显微镜在全层结肠标本中评估ENS神经元和胶质细胞组织。关键结果：接受SMM的雌性无菌小鼠与性别匹配对照及雄性相比，表现出更高的远端GI转运效率和肌间神经丛中更高比例的氮能神经元（nitrergic neurons）。雌性无菌小鼠肌间神经节中胆碱乙酰转移酶（ChAT；兴奋性胆碱能神经元标志物）免疫反应性高于雄性。SMM和MFM雄性中ChAT免疫反应性增加，而NSM和MFM雌性中较对照显著降低。婴儿微生物组不影响肌间胶质细胞，后者在所有组中雄性多于雌性。结论与推论：研究结果表明，生命早期母体分泌型相关的婴儿微生物组对ENS神经元表型和GI动力发挥性别特异性效应，揭示了婴儿来源微生物组与ENS发育之间此前未被认识的联系，值得在更大队列中研究。

**研究背景**

肠神经系统（enteric nervous system，ENS）是调控胃肠道（gastrointestinal，GI）动力、分泌、肠道血流及感觉转导的高度特化神经网络，解剖上包含4亿至6亿个神经元和胶质细胞，沿整个GI tract分布并组织为肌间神经丛（myenteric plexus）和黏膜下神经丛（submucosal plexus）两大神经节丛。尽管ENS基础架构在胚胎期已建立，其成熟过程延伸至出生后早期，此发育窗口以显著神经可塑性和对环境线索（包括肠道微生物组）的高度敏感性为特征。近十年来，肠道微生物群已成为ENS发育的关键调控者。生命早期定植模式受喂养方式（人乳或牛乳配方）强烈影响。人乳通过提供有益细菌及脂肪酸、寡糖等营养因子塑造婴儿微生物组，其中人乳寡糖促进双歧杆菌（Bifidobacterium）选择性扩增，而分泌型母亲所产婴儿中该菌丰度更高。生命早期微生物组-宿主共发育轨迹的紊乱与功能性肠病（如肠易激综合征、功能性消化不良、婴儿肠绞痛）的发育起源相关。无菌、悉生及抗生素处理动物模型研究显示，破坏早期微生物暴露会改变ENS结构、损害神经肌肉功能并导致持久动力缺陷。然而，母体分泌型状态如何通过塑造早期微生物环境影响ENS成熟，直接证据仍未被探索。母体分泌型状态由岩藻糖基转移酶2（fucosyltransferase 2，FUT2）基因表达决定，分泌型母亲产生高水平2′-岩藻糖基乳糖（2′-fucosyllactose，2′FL），非分泌型母亲产生很少或不产生。Gurung等此前证明，分泌型母亲喂养的婴儿肠道微生物群富含Bacteroides、Parabacteroides和Bifidobacterium，且该婴儿微生物组移植入幼年无菌小鼠后影响GI生理和免疫功能。鉴于无菌小鼠存在肠神经元密度、胶质结构、神经传递和肠道动力改变，是解析微生物群依赖ENS发育机制的强有力模型，研究人员在此基础上探究母体喂养状态编程的婴儿微生物群如何影响GI功能和出生后ENS发育。

**关键技术方法**

研究人员从Happy Tummies研究（临床试验#NCT03493711）中收集3–3.5月龄人乳或乳基配方喂养婴儿的粪便样本，按分泌型（n=5）、非分泌型（n=5）或配方（n=5）分组混合。将21–23日龄雄性和雌性C57BL/6无菌小鼠随机分为SMM、NSM、MFM及对照（vehicle）四组，实验期14天，于第1天和第7天经口灌胃100 μL粪便接种物。于出生后第35–37天采集粪便行16S rRNA基因V3-V4区测序及生物信息学分析（QIIME2、SILVA数据库、MicrobiomeAnalyst）。采用不可吸收FITC-葡聚糖（250 kDa）示踪剂于灌胃后40 min和180 min两个时间点评估GI转运，计算几何中心（geometric center，GC）。结肠组织行免疫组化与组织透明化，用共聚焦显微镜成像分析HuC/D、nNOS、ChAT、substance P及GFAP/S100β标记。数据以双因素方差分析（two-way ANOVA）结合Tukey多重比较检验分析，以婴儿喂养状态和性别为主效应。

**研究结果**

3.1 婴儿喂养状态影响粪便微生物组组成而不影响肠道黏膜结构形态：Bray–Curtis β多样性显示婴儿喂养状态导致粪便微生物组组成明显聚类（PERMANOVA R2=0.93，p=0.001）；LEfSe分析显示SMM组富集Bacteroides、Hungatella和Ruminococcus，NSM组富集Bifidobacterium和Akkermansia，MFM组富集Blautia、Enterocloster和Collinsella；MFM组α多样性显著高于SMM或NSM组；雄雌小鼠间这些效应一致；小肠绒毛高度、隐窝深度及盲肠结肠腺深度组间无差异。

3.2 母乳或乳基配方喂养婴儿的微生物群不影响小肠腔内内容物推进：40 min时FITC-葡聚糖在各肠段分布存在显著差异（P_{Intestinal segments}<0.0001），SI4荧光显著高于其他肠段；雄性NSM组SI3荧光较SI1、2、6、胃、盲肠和结肠增加，提示NSM组动力较慢；雌性SMM组SI5（回肠）荧光较对照显著降低，提示SMM组小肠远端内容物推进较慢；GC和胃排空组间无差异。

3.3 分泌型母亲喂养婴儿的微生物群增加雌性小鼠大肠腔内内容物推进：180 min时标记物荧光峰主要在盲肠；雄性各组间无差异；雌性中三个处理组较对照均可见腔内内容物推进增加（P_interaction<0.05）；对照雌性SI5和SI6荧光显著高于SMM（SI5 p<0.05；SI6 p<0.01）和NSM（SI6 p<0.01），而盲肠荧光对照低于SMM（p<0.01）；雌性SMM组GC（8.389）高于对照（6.723），但未达统计学显著（p=0.063）；胃排空组间无差异。

3.4 分泌型母亲喂养婴儿的微生物群增加雌性小鼠ENS氮能神经元群体：双因素方差分析显示对HuC/D+（P_interaction=0.0098）及nNOS+HuC/D+神经元（P_interaction=0.0243）密度存在显著交互效应；雄性NSM小鼠HuC/D+神经元密度显著高于同组雌性（p<0.01）；雌性SMM（p<0.05）和MFM（p<0.05）小鼠nNOS+HuC/D+神经元密度显著高于同组雄性；雌性SMM小鼠nNOS+HuC/D+神经元密度较性别匹配对照显著增加（p<0.05）；nNOS+HuC/D+神经元占HuC/D+神经元百分比在雌性SMM中较性别匹配对照（p<0.05）及同组雄性（p<0.05）显著升高。

3.5 母乳或乳基配方喂养婴儿的微生物群以性别依赖方式影响ENS兴奋性神经元组分：微生物群对肌间神经丛ChAT免疫反应性有显著效应（P_Microbiota=0.0162）及性别依赖交互（P_Interaction=0.0008）；无菌雌性ChAT免疫反应性高于雄性（p<0.01）；雄性SMM组ChAT免疫反应性较对照显著增加（p<0.01）；雌性NSM和MFM组ChAT免疫荧光较对照显著降低（p<0.01）；SMM和MFM组ChAT免疫反应性雄性显著高于雌性（p<0.05）；substance P免疫反应性神经纤维未受影响。

3.6 两周微生物群定植不影响结肠肌间神经丛胶质细胞发育：雄性无菌小鼠每肌间神经节面积GFAP+S100β+细胞数显著高于雌性，移植后该差异维持（P_sex<0.0001）；胶质细胞与神经元比值受性别（P_Sex<0.0001）和微生物群（P_Microbiota=0.0482）影响，雄性显著高于雌性（p<0.01）；SMM和MFM组雄性该比值仍高于雌性（p<0.01）；雄性SMM胶质-神经元比值显著高于性别匹配NSM（p<0.05）；提示幼年无菌雄性小鼠胶质-神经元比值高于雌性，且该关系似乎不受微生物组影响。

**讨论与结论**

生命早期是肠道微生物组与ENS并行发育、奠定远期GI功能基础的关键时期，初始微生物定植在神经元分化、胶质发育、突触组织和神经介导肠道动力的生理发育等多方面影响ENS成熟。研究人员于出生后第21天（ENS成熟关键阶段，肌间和黏膜下神经丛已完全建立但仍进行神经元精修、突触发生和肠胶质扩增）行粪便移植，该时间点具转化相关性，且断奶期移植的微生物定植较成年期更有效。结果显示ENS发育结局存在性别依赖改变，尤其雌性小鼠，与雌性对早期微生物扰动更敏感的证据一致。雌性SMM小鼠在180 min后远端GI转运效率较性别匹配无菌对照显著增加，雄性组未检测到变化。多种机制可能解释雌性选择性反应，包括黏膜聚糖表达差异、上皮和ENS信号激素调控、免疫-微生物群互作、迷走信号、应激反应和下丘脑-垂体-肾上腺轴活动的性别差异，以及雌激素介导的肠神经元发育调控。雌性SMM远端GI转运效率增加与结肠肌间神经节氮能神经元比例升高一致；早期抗生素暴露通过减少氮能神经元破坏ENS成熟并伴转运延迟和便秘样表型，微生物产物经Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）信号支持氮能神经元发育，Bacteroides为TLR2已知激活剂，本研究雌性SMM和MFM组Bacteroides丰度较高，提示氮能神经元恢复可能由Bacteroides介导的TLR2信号驱动。关于兴奋性神经传递，无菌条件下雌性ChAT免疫反应性显著高于雄性，提示微生物信号缺失不成比例增强雌性ENS兴奋性胆碱能张力；微生物移植产生性别分歧效应，雄性SMM和MFM定植后ChAT免疫反应性增加提示微生物群帮助恢复兴奋性神经传递，雌性NSM和MFM组ChAT免疫反应性显著降低提示微生物定植使原本升高的胆碱能张力正常化。关于肠胶质细胞，表达GFAP和S100β的肌间神经节内胶质（对应I型肠胶质细胞）雄性多于雌性，胶质-神经元比值除NSM队列外在所有雄性组升高，提示在本样本量限度内婴儿来源微生物组未明显改变肌间胶质密度，性别依赖差异较微生物组特异效应更突出。总体而言，研究结果支持母体分泌型表型编程的微生物定植可能以性别特异方式影响肠道动力和ENS发育。研究局限性包括未纳入常规饲养小鼠比较、未补充人乳寡糖（human milk oligosaccharides，HMO）以维持分泌型来源微生物群生长；未来方向包括考察微生物群驱动的肠道动力改变是否持续至成年、结合早期微生物暴露与HMO补充以更好模拟生理条件、评估不同微生物群代谢谱以识别机制性连接微生物组与ENS成熟的代谢物或通路。研究结论为：研究结果证明生命早期母体分泌型相关婴儿微生物组对ENS神经元表型和GI动力发挥性别特异性效应，揭示了婴儿来源微生物组与ENS发育之间此前未被认识的联系，值得在更大队列中研究。