SCN2A相关发育性癫痫性脑病小鼠模型Scn2aE430A的神经元兴奋性增高与癫痫易感性研究

《Neurobiology of Disease》：Elevated neuronal excitability and seizure susceptibility in a mouse model of SCN2A-related developmental and epileptic encephalopathy

　　

致病性SCN2A变异对编码电压门控钠通道Na_V1.2产生广泛的生物物理效应，该通道主要在中枢神经系统表达。相应地，SCN2A变异与一系列异质性神经发育障碍（NDDs）相关，反映了通道特性改变与表型之间的复杂关系。一般而言，在通道水平具有Na_V1.2功能获得性（GoF）效应的SCN2A变异与新生儿期或婴儿早期起病的癫痫相关，而功能丧失性（LoF）效应则与智力障碍和/或孤独症谱系障碍表型相关，伴或不伴迟发性癫痫。癫痫相关SCN2A变异导致GoF还是LoF效应对疾病进展和治疗反应具有提示意义。GoF变异通常与较早的癫痫发作年龄（≤1月龄）及对苯妥英和卡马西平等钠通道阻滞剂的良好治疗反应相关。相反，LoF效应变异与较晚的癫痫发作年龄（≥3月龄）及钠通道阻滞剂治疗后癫痫加重相关。对于GoF效应，额外的异质性来自对通道影响的性质和程度差异，导致从自限性家族性新生儿-婴儿癫痫（SeLFNIE）到发育性癫痫性脑病（DEE）的谱系。这些基因型-表型相关性凸显了SCN2A变异表征及反映SCN2A相关癫痫异质性的建模方法的重要性。目前已开发多种小鼠模型以研究具有不同生物物理效应的SCN2A GoF变异。Scn2a^Q54模型在海马神经元中具有升高的持续性电流、青少年期起病的癫痫和过早致死；然而该模型为携带由非天然启动子驱动的合成突变转基因的半合子。患者相关变异SCN2A-p.A263V与不同严重程度的癫痫表型相关，导致持续性钠电流升高、失活电压依赖性去极化及失活动力学改变。同合子Scn2a^A263V敲入小鼠表现出频繁的终生自发性癫痫发作；而反映受影响人类等位基因剂量的杂合子仅在新生儿期出现自限性电图癫痫发作。相反，DEE相关变异SCN2A-p.R1882Q的杂合子小鼠自出生起即出现自发性癫痫发作并伴有青少年期致死；然而这些小鼠尚未公开可用。p.R1882Q变异导致电压依赖性去极化、失活减慢及持续性和复活性钠电流增强，从而导致兴奋性皮层神经元动作电位（AP）发放频率增高。需要额外的捕捉不同生物物理机制的鼠标模型来扩展研究SCN2A相关DEE的工具库。错义变异SCN2A-p.E430A在两个无亲缘关系的早发性DEE个体中被报道为新发变异。与许多影响多种通道特性的GoF变异（如p.A263V和p.R1882Q）不同，p.E430A变异仅影响激活的电压依赖性。由此产生的激活电压依赖性超极化位移预计通过增强阈下去极化期间钠通道的募集来增加神经元兴奋性。为进一步研究p.E430A变异的影响，研究人员构建了携带p.E430A变异的Scn2a小鼠模型，并检测了其对神经元兴奋性、脑活动、癫痫敏感性和苯妥英反应性的影响。研究人员发现Scn2a^E430A海马神经元具有超极化的动作电位阈值、更低的基强度和更高的AP发放频率。CA1海马回路的长期增强也增强，提示异常的突触信号传导，而突触前释放概率不受影响。在整体动物水平，Scn2a^E430A小鼠表现出发作间期癫痫样活动和频谱功率改变，以及对诱导性癫痫的敏感性增强，表现为更快的泛化和高致死率，而苯妥英治疗可减轻这些表现。研究结果表明，Na_V1.2激活电压依赖性的超极化导致神经元超兴奋性、异常突触可塑性和脑活动改变，确立Scn2a^E430A小鼠作为研究独特SCN2A GoF机制相关癫痫后果的有用模型。

研究背景方面，SCN2A基因编码电压门控钠通道Na_V1.2，主要表达于中枢神经系统。SCN2A致病性变异对通道产生广泛的生物物理效应，与一系列异质性神经发育障碍相关。在通道水平具有功能获得性（GoF）效应的变异通常与新生儿期或婴儿早期起病的癫痫相关，并对钠通道阻滞剂治疗反应良好；而功能丧失性（LoF）效应变异则与智力障碍和/或孤独症谱系障碍相关，伴或不伴迟发性癫痫。在GoF变异中，根据对通道影响的性质和程度不同，表型可从自限性家族性新生儿-婴儿癫痫（SeLFNIE）到发育性癫痫性脑病（DEE）。目前已开发多种SCN2A GoF变异小鼠模型，但各有局限：Scn2a^Q54模型为携带合成突变的转基因半合子，由非天然启动子驱动；Scn2a^A263V同合子小鼠有频繁自发性癫痫发作但杂合子仅新生儿期自限性电图发作；Scn2a^R1882Q杂合子小鼠有自出生起自发性癫痫发作和青少年期致死，但尚未公开可用。SCN2A-p.E430A是在两个无亲缘关系早发性DEE个体中报道的新发错义变异，与影响多种通道特性的其他GoF变异不同，该变异仅影响激活的电压依赖性，导致激活电压依赖性超极化位移。因此，研究人员构建了携带p.E430A变异的Scn2a小鼠模型，旨在研究选择性激活门控改变如何影响神经元兴奋性、回路整合和体内脑表型。研究得出以下结论：E430A变异产生GoF表型，导致神经元超兴奋性、Schaffer侧支-CA1突触海马长期增强（LTP）增强、发作间期癫痫样放电的脑活动改变，以及对多种致癫痫诱导剂的敏感性增强，且可被抗癫痫药物苯妥英减轻。这些发现确立Scn2a^A/+小鼠作为研究SCN2A GoF相关癫痫表型的临床相关且药理学可操作的模型。其重要意义在于，该模型捕捉了独特SCN2A GoF机制的癫痫相关后果，为剖析变异特异性机制和评估靶向治疗策略提供了宝贵平台。

在技术方法方面，研究人员采用AlphaFold3进行蛋白结构建模并与冷冻电镜结构比较以分析E430A的结构影响；在HEK293T细胞中进行异源全细胞电压钳记录评估Na_V1.2通道功能；利用CRISPR/Cas9编辑结合同源定向修复在C57BL/6J小鼠两细胞期胚胎中构建Scn2a^E430A小鼠模型（该品系Scn2a^em1Kea已提交至MMRRC保存，编号MMRRC_075779-UCD），并通过PCR和Sanger测序进行基因分型及脱靶筛查，采用ddPCR和免疫印迹进行表达分析；对原代培养海马锥体神经元进行全细胞电流钳记录；对急性海马切片进行CA1场电位记录评估突触前功能和LTP；对成年小鼠进行视频-EEG记录分析基线脑活动和频谱功率；采用电休克（ECS）、氟罗西尔和红藻氨酸（KA）三种诱导范式评估癫痫易感性及苯妥英反应性。

研究结果方面：第一，E430A对Na_V1.2通道功能的影响——谷氨酸430位于Na_V1.2的DI-DII胞质环近端，该位点在SCN2A直系同源和旁系同源基因中不变。结构建模预测E430A导致与DI S4-S5连接区K247的氢键丢失，该区域对电压传感与通道开放的耦联至关重要。全细胞电压钳记录显示E430A通道激活电压依赖性显著超极化（WT：?17.7±1.0 mV；E430A：?22.2±1.2 mV，p=0.0088），而失活电压依赖性、失活恢复、频率依赖性衰减及持续性钠电流均无差异。第二，Scn2a^E430A小鼠的构建和初步表征——通过CRISPR/Cas9和同源定向修复引入单核苷酸改变，杂合子Scn2a^A/+和WT小鼠以预期孟德尔比例出生且无生存缺陷，而同合子Scn2a^A/A小鼠表现围产期死亡。前脑Scn2a转录本和Na_V1.2蛋白水平在Scn2a^A/+与WT之间无差异。第三，Scn2a^A/+海马锥体神经元内在兴奋性改变——培养海马神经元（DIV14-16）显示Scn2a^A/+神经元较WT超兴奋，具有更低的基强度电流、超极化的动作电位阈值和更大的快速后超极化（fAHP）幅度，而静息膜电位、AP幅度、半宽、上升和下降速率及输入电阻无改变。第四，Scn2a^A/+海马切片中LTP增强——Schaffer侧支-CA1通路的配对脉冲比（PPR）在基因型间无差异，表明基础突触前释放概率不受影响；而经θ爆发刺激（TBS）诱导的LTP在Scn2a^A/+小鼠显著大于WT（A/+：197.9±22.8%；WT：134.8±7.06%；p<0.03），表明GoF变异E430A增强海马长期增强而短期突触释放不变。第五，Scn2a^A/+小鼠EEG异常——连续视频-EEG记录显示RMS幅度在光/暗周期均无基因型差异，但PSD分析显示光照期Scn2a^A/+小鼠delta（0-4 Hz；p<0.0001）和theta（4-8 Hz；p=0.0287）频段功率显著降低，暗期无差异。手动检查发现Scn2a^A/+小鼠出现反复高幅度癫痫样放电，表现为孤立放电或短暂串（<2 min），所有Scn2a^A/+小鼠均可检测到，对应频谱功率瞬时增加，但未检测到自发性全面性癫痫发作。第六，Scn2a^A/+小鼠癫痫易感性和苯妥英反应性——在ECS亚阈值刺激下，Scn2a^A/+小鼠80%（8/10）出现后肢强直伸展（HLE）并死亡，而WT无HLE（p<0.0001），苯妥英预处理完全阻止Scn2a^A/+小鼠HLE（p<0.0001）。氟罗西尔暴露后GTCS潜伏期不受基因型或苯妥英影响，但Scn2a^A/+小鼠93%进展为严重结局（HLE或死亡），WT仅22%（p<0.0001），苯妥英预处理改善两基因型结局。KA给药后Scn2a^A/+小鼠93%（28/30）达到GTCS，潜伏期41.2±3.77 min，WT为59%（17/29），潜伏期62.4±6.93 min（p<0.0001）；Scn2a^A/+小鼠KA后死亡率90%（27/30），WT为24%（7/29）（p<0.0001），苯妥英预处理改善Scn2a^A/+小鼠生存但未影响GTCS进展。多种诱导范式下Scn2a^A/+小鼠显示相似的全面性癫痫发作潜伏期，但表现出增强的演化和不良结局。

讨论部分总结：本研究构建并表征了携带患者相关SCN2A-p.E430A变异的小鼠模型，证明该变异产生GoF表型，导致神经元超兴奋性、海马LTP增强、发作间期癫痫样放电及多种诱导剂癫痫敏感性增强，可被苯妥英减轻。E430位于D1 S4-S5连接区附近，结构建模预测E430A破坏与K247的氢键，可能降低通道开放阈值，解释激活超极化位移。GoF效应在神经元水平导致超兴奋性，在海马回路水平PPR不变而LTP增强，提示突触后变化；降低树突Na_V1.2通道激活阈值可能放大θ爆发刺激期间的反向传播动作电位，产生更大去极化、更完全NMDA受体Mg²⁺解除阻断和更高钙内流，足以降低LTP诱导阈值。这与Na_V1.2活性与CA1 LTP的双向关系一致：LoF变异抑制LTP而GoF变异增强LTP。超兴奋状态支持反复兴奋并降低发作间期棘波和癫痫样活动的屏障。EEG显示反复发作间期癫痫样放电伴频谱功率瞬时增加但无自发性癫痫发作，发作间期癫痫样放电是SCN2A相关DEE的公认特征。尽管无自发性癫痫发作，Scn2a^A/+小鼠对致惊厥刺激的严重性和致死性增强，但初始癫痫发作征象潜伏期不受影响，提示E430A GoF变异主要影响癫痫传播或终止而非起始。苯妥英治疗改善所有诱导范式中的癫痫结局，与苯妥英已知疗效一致，支持该突变赋予可被钠通道阻滞剂治疗的GoF钠通道表型。与Scn2a^A263V和Scn2a^K1422E等其他模型一致，杂合子Scn2a^A/+小鼠成年后未表现自发性癫痫发作；未来可研究早期产后时间点及遗传背景影响。本研究聚焦电生理和癫痫相关体内表型，未评估发育和认知表型。研究结论翻译：总之，研究结果表明选择性破坏Scn2a激活门控足以产生神经元超兴奋性、发作间期EEG异常、癫痫严重性增高和钠通道阻滞剂反应性。Scn2a^A/+小鼠模型再现了SCN2A GoF变异相关的多种癫痫表型，为剖析变异特异性机制和评估靶向治疗策略提供了宝贵平台。