缺乏烟酰胺核苷酸转氢酶（NNT）的雄性和雌性同源基因小鼠全身葡萄糖耐量受损

《Physiological Reports》：Whole-body glucose tolerance is impaired in male and female congenic mice lacking nicotinamide nucleotide transhydrogenase (NNT)

　　

烟酰胺核苷酸转氢酶（NNT）是一种线粒体氧化还原蛋白。既往关于NNT缺陷损害年轻雄性小鼠葡萄糖耐量的报道可能受到背景品系差异的混杂影响。本研究探讨了在同源基因小鼠模型中NNT缺失是否会在不同性别和年龄中诱导葡萄糖不耐受。研究人员在成年（6月龄）和老年（24月龄）雄性及雌性同源基因小鼠中进行了间接测热法、口服葡萄糖耐量试验和组织分析，这些小鼠携带（Nnt^WT）或不携带（Nnt^Δ）NNT（n = 8–15）。尽管老年小鼠表现出体重增加和空腹胰岛素水平升高（p < 0.0001），但NNT缺陷并未影响这些参数、能量消耗或底物利用，在两种性别中均如此。摄入葡萄糖后，两种性别的Nnt^Δ小鼠葡萄糖耐量均恶化。成年雌性小鼠的葡萄糖刺激血清胰岛素不受影响，但24月龄Nnt^Δ雌性小鼠（p = 0.009）和6月龄Nnt^Δ雄性小鼠（p = 0.0303）的葡萄糖刺激血清胰岛素较低。然而，在葡萄糖给药后30分钟采集的骨骼肌中，基因型对葡萄糖刺激的信号通路（包括PI3K、STAT3、磷酸化-AKT、肌膜GLUT4定位）没有影响（p > 0.295）。同样，肝脏或肠系膜白色脂肪组织（mWAT）内葡萄糖刺激的AKT磷酸化比值在基因型之间也无差异。综上所述，同源基因NNT缺陷在雄性和雌性成年及老年小鼠中均诱导全身葡萄糖不耐受。

**研究背景与问题提出**

烟酰胺核苷酸转氢酶（NNT）是位于线粒体内膜的一种酶，在能量代谢和抗氧化防御中发挥关键作用。NNT利用线粒体内膜两侧的质子动力势生成NADPH，而NADPH对于再生细胞抗氧化防御系统和维持氧化还原平衡至关重要。由于慢性升高的活性氧（ROS）足以损害全身葡萄糖处理能力，长期以来研究人员一直关注NNT在调节葡萄糖耐量中的潜在作用。NNT与葡萄糖代谢之间的关系最初是在C57BL/6J亚系中发现的，该亚系携带NNT失活突变，与保留完整NNT等位基因的C57BL/6N品系相比，表现出葡萄糖耐量受损。然而，其他研究表明NNT缺陷不影响或仅适度影响胰岛素分泌或葡萄糖耐量，NNT在葡萄糖稳态中的具体作用仍存在争议。此前研究的主要问题在于C57BL/6J小鼠复杂的遗传背景——由于基因组中存在多个其他突变，除NNT外还有多种蛋白质功能缺失，可能影响葡萄糖耐量。此外，现有关于NNT在葡萄糖稳态中作用的文献主要集中于雄性小鼠和生命早期阶段，而雌性啮齿类动物已被证实对葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗具有保护作用，因此不能假定NNT缺陷的代谢效应在雌雄之间完全相同。鉴于目前相互矛盾的发现、雌性可能的代谢保护作用以及既往使用混杂非同类系小鼠模型的局限性，研究人员旨在探究NNT缺陷是否在不同年龄的两种性别中对葡萄糖耐量产生差异性影响。为此，研究人员构建了同源基因小鼠模型，携带完整的Nnt等位基因（B6JRcc(B6J)-Nnt⁺/Wuhap）或Nnt缺失（BL6JRcc.BL6J-Nnt^C57BL/6J/Wuhap），从而可将基因型间观察到的差异归因于NNT功能障碍而非亚系累积的变异。研究假设缺乏NNT的小鼠会表现出口服葡萄糖耐量受损，且这一现象在两种性别中均存在并在老年时加剧。

**主要技术方法概述**

研究人员使用本实验室繁育的同源基因Nnt^Δ和Nnt^WT小鼠，在6月龄和24月龄的雄性和雌性中进行实验（n = 8–15）。主要技术方法包括：（1）口服葡萄糖耐量试验（OGTT）评估葡萄糖和胰岛素稳态，并计算胰岛素抵抗稳态模型评估指数（HOMA-IR）、β细胞功能稳态模型评估指数（HOMA-β）和肝脏胰岛素抵抗指数（HIRI）；（2）间接测热法（InCa）通过PhenoMaster系统实时监测能量代谢，包括耗氧量（VO₂）、二氧化碳产量（VCO₂）、呼吸交换比（RER）、能量消耗（EE）和身体活动；（3）Western blot检测骨骼肌、肝脏和肠系膜白色脂肪组织（mWAT）中NNT、磷酸化AKT（Ser473和Thr308）、AKT2、PI3K、STAT3、mTOR等蛋白表达和磷酸化水平；（4）免疫组织化学评估骨骼肌肌膜GLUT4定位，使用Manders共定位系数（MCC）进行定量分析。此外，实验还测量了体重、体成分（脂肪量和瘦体重）及每周食物摄入量。

**研究结果**

**老年而非NNT缺陷显著改变两种性别的体成分和全身代谢**：老年（24月龄）雄性和雌性小鼠均表现出体重、脂肪量、瘦体重和每周食物摄入量显著增加（p < 0.0001），身体活动显著下降，空腹RER降低并伴随碳水化合物氧化减少。然而，NNT缺陷对上述任何生理参数、能量消耗或底物利用均无显著影响，基因型与年龄之间也无交互作用。

**NNT缺陷损害雄性小鼠口服葡萄糖耐量而不改变空腹血糖**：雄性小鼠空腹血糖在各年龄组和基因型间无差异，而空腹胰岛素、HOMA-IR和HOMA-β在老年雄性中升高（p < 0.0001），不受基因型影响。OGTT中，Nnt^Δ雄性在6月龄和24月龄血糖均高于Nnt^WT（p < 0.0001），曲线下面积（AUC）相应更高。6月龄Nnt^Δ雄性血清胰岛素在0–30分钟窗口显示基因型主效应（p = 0.030），24月龄时基因型效应未达显著（p = 0.055）。胰岛素AUC在老年雄性中更高（p < 0.0001），基因型间无显著差异。HIRI随年龄升高（p < 0.0001），不受基因型影响。

**NNT缺陷损害雌性小鼠葡萄糖稳态并在老年降低胰岛素反应**：年龄而非NNT缺陷是空腹血糖（p = 0.011）、血清胰岛素（p < 0.0001）、HOMA-IR（p < 0.0001）和HOMA-β（p < 0.0001）受损的主要驱动因素。OGTT中，6月龄Nnt^Δ雌性葡萄糖清除显著受损（p = 0.014）；24月龄时基因型主效应呈趋势（p = 0.060），但存在显著交互作用（p = 0.008），葡萄糖AUC在Nnt^Δ中显著更高（p = 0.002）。6月龄时循环胰岛素无基因型效应，但老年小鼠中基因型对胰岛素水平有显著主效应（p = 0.009），Nnt^Δ小鼠胰岛素较低。

**NNT缺陷不改变葡萄糖刺激的信号通路**：在葡萄糖给药后30分钟，雄性及雌性小鼠骨骼肌中磷酸化AKT（Ser473）、总AKT2水平及p-AKT/AKT2比值在基因型间无显著差异。雌性中，葡萄糖刺激与空腹信号的比值显示Nnt^Δ雌性p-AKT（Ser473）/AKT2折叠诱导较低（p = 0.0197），老年雌性也较低（p = 0.0361）。雌性骨骼肌中除总mTOR在Nnt^Δ中降低外（p = 0.0113），AKT（Thr308）、STAT3和mTOR（Ser2448）磷酸化在基因型间无差异。骨骼肌肌膜GLUT4共定位在基因型间无差异。肝脏和mWAT中AKT信号也无基因型差异，但老年小鼠肝脏和mWAT中p-AKT（Ser473）/AKT2比值较低（p ≤ 0.0003），源于AKT2升高（p ≤ 0.0005）。

**讨论与结论**

讨论部分指出，本研究的主要优势在于使用了明确构建的同源基因小鼠模型，避免了混杂遗传背景效应，并同时分析了雌雄两种性别在两个年龄段的数据。综合体内代谢测量证实，基线生理参数和底物氧化不受NNT缺陷影响。关于葡萄糖耐量，数据揭示NNT缺陷在成年和老年雄性和雌性小鼠中均显著损害葡萄糖耐量，且这一现象不伴随骨骼肌、肝脏和mWAT中AKT磷酸化或骨骼肌GLUT4转位的差异。研究人员指出，NNT缺陷可能以性别和年龄依赖的方式影响葡萄糖刺激的胰岛素分泌——雄性在成年期即表现胰岛素水平降低，而雌性直至老年才出现。尽管GLUT4转位在葡萄糖负荷后30分钟已被证实达到峰值，但本研究中未观察到葡萄糖刺激条件下骨骼肌AKT磷酸化高于空腹条件，可能组织水平反应在30分钟时已恢复基线。研究人员承认研究局限：30分钟组织采集可能错过了15分钟的内源性胰岛素峰值，且外源性胰岛素刺激将提供更严格的组织特异性胰岛素敏感性指标，未来需结合胰岛素耐量试验（ITT）和胰岛素刺激组织分析。此外，老年小鼠尽管葡萄糖耐量改善（葡萄糖AUC降低），但空腹胰岛素、HOMA-IR和HOMA-β升高，OGTT期间胰岛素水平大幅上调，这与先前报道老年小鼠因肝脏胰岛素清除减少而维持较高循环胰岛素水平的发现一致。年龄相关的葡萄糖耐量和组织蛋白含量变化独立于NNT的存在与否。研究结论部分翻译如下：通过使用同源基因小鼠模型，本研究确立了NNT是全身葡萄糖稳态的重要调节因子。研究人员报道，缺乏NNT的雄性和雌性小鼠在成年和老年阶段均表现葡萄糖耐量受损。研究结果将NNT定位为维持葡萄糖稳态的重要靶点，并确定该同源基因小鼠模型为研究NNT作用的直接模型。