Sox10CreERT2驱动报告基因标记在生理与炎症条件下小鼠肠胶质细胞中的长期持久性

《Physiological Reports》：Long-term persistence of Sox10CreERT2-driven reporter labeling in enteric glia of mice under physiological and inflammatory conditions

　　

诱导型Cre-lox系统（inducible Cre-lox systems）广泛用于体内操纵肠胶质细胞（enteric glia）。然而，Cre介导重组后报告基因的长期表达特征仍缺乏系统表征，尤其是在伴随细胞重塑的炎症条件下。本方法学文章评估了Sox10+肠胶质细胞内报告基因随时间推移的持久性。Sox10CreERT2+/?; tdTomatofl/fl报告小鼠接受两次他莫昔芬（tamoxifen）注射，间隔48 h。研究人员通过免疫组织化学方法，对诱导后长达7个月的纵行肌-肌间神经丛（longitudinal muscle-myenteric plexus）与黏膜下神经丛（submucosal plexus）全层铺片进行分析。为评估炎症条件下tdTomato报告基因表达的持久性，研究人员在他莫昔芬给药后采用葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）或二硝基苯磺酸（dinitrobenzene sulfonic acid，DNBS）诱导小鼠结肠炎，并于1个月后定量报告基因表达。他莫昔芬处理在Sox10+肠胶质细胞中产生高效的tdTomato报告基因标记，两种铺片中均超过95%的胶质细胞表达tdTomato。在生理条件下，报告基因表达稳定维持长达7个月。在DSS或DNBS诱导结肠炎后，tdTomato+/Sox10+细胞比例与健康对照相似。他莫昔芬处理可在Sox10+肠胶质细胞中诱导高效且持久的报告基因表达，该表达在生理条件下可维持数月，在炎症后可持续长达1个月。本研究为基于Sox10CreERT2驱动的肠胶质细胞长期报告基因标记研究建立了实用框架。

研究背景与问题

肠神经系统（enteric nervous system，ENS）是分布于肠壁内、由神经元与胶质细胞构成的广泛网络，负责对胃肠动力、分泌及屏障功能进行实时调控。肠胶质细胞日益被认为是肠道稳态调节的重要参与者，可影响神经元环路内信号传递、上皮完整性与免疫-神经交互，并在疾病状态下改变ENS反应。诱导型Cre-lox遗传系统广泛用于体内研究肠神经元与胶质细胞的特异性功能，可实现对特定细胞群基因重组的时间控制。该策略通常被假定在神经元等稳定细胞群中可提供持久表达，但肠胶质细胞在特定条件下表现出更强的可塑性与更新能力，其长期标记稳定性尚不清楚。既往研究提示，Sox10⁺肠胶质细胞包含可在损伤后生成神经元的肠神经祖细胞群体，表明肠胶质细胞可响应环境刺激而改变表型与谱系潜能。若新生细胞来源于他莫昔芬给药时未发生重组的群体，则可预期报告基因阳性细胞随时间逐渐稀释；反之，若新生胶质细胞来源于已重组的Sox10⁺细胞或其子代，则谱系标记应随时间持续存在。因此，研究人员采用急性他莫昔芬给药，在Sox10^CreERT2+/?; tdTomato^fl/fl报告模型中直接评估Rosa26-tdTomato报告基因标记在生理条件及炎症刺激后的长期持久性。

研究内容与结论

研究人员在11周龄、雌雄兼用的Sox10^CreERT2+/?; tdTomato^fl/fl小鼠及Sox10^CreERT2?/?; tdTomato^fl/fl对照小鼠中，以10 mg/kg剂量腹腔注射他莫昔芬两次、间隔48 h，并于诱导后1、3、5、7个月取材，或在诱导后1个月诱导结肠炎（DSS 3%饮水7天或DNBS 0.2 mg/g体重经直肠给药）后取材，对结肠纵行肌-肌间神经丛（LMMP）与黏膜下神经丛（SMP）全层铺片行免疫组织化学分析。结论为：他莫昔芬处理可在Sox10⁺肠胶质细胞中诱导高效且持久的报告基因表达，生理条件下至少维持7个月，实验性结肠炎后1个月仍维持，未见显著报告基因丢失；该工作为肠胶质细胞长期谱系标记研究提供了实用框架。

关键技术方法

研究采用Sox10^CreERT2与Rosa26-CAG-LSL-tdTomato（Ai14）报告小鼠杂交模型，经腹腔注射他莫昔芬诱导重组；以DSS饮水与DNBS直肠给药建立两种互补结肠炎模型；对结肠LMMP与SMP全层铺片行免疫组织化学，标记tdTomato、Sox10与HuC/D；采用落射荧光显微镜与共聚焦显微镜成像，并以Fiji（ImageJ）手工定量细胞；统计学采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及Bonferroni事后检验。动物实验经密歇根州立大学机构动物护理与使用委员会批准（AUF# PROTO202400108）。

研究结果

tdTomato⁺/Sox10⁺细胞定量：Sox10^CreERT2?对照中无tdTomato表达，证实报告基因特异性；未给予他莫昔芬的Sox10^CreERT2+小鼠中，两种神经丛均检出少量tdTomato阳性细胞（肌间神经丛MP：23.6% ± 11.2%；黏膜下神经丛SMP：27.5% ± 8.1%），且均共表达Sox10，提示无他莫昔芬时存在低水平Cre泄漏；肌层相关胶质细胞中该比例更高（42.1% ± 19.6%），提示该区域基线重组增强。他莫昔芬诱导后，MP与SMP中几乎所有Sox10⁺胶质细胞均强表达tdTomato：MP在1、3、5、7个月分别为96.6% ± 2.4%、98.3% ± 0.6%、98.2% ± 1.3%、98.8% ± 1.0%；SMP分别为98.7% ± 1.6%、99% ± 0.9%、99% ± 1.3%、97.1% ± 1.0%；肌层相关胶质细胞分别为96.1% ± 4.6%、100%、99.4% ± 1.3%、99.5% ± 1.3%，标记在诱导后长达7个月内保持稳定。LMMP中偶见tdTomato阳性神经元，其比例在各时间点低且相对稳定（1个月0.94% ± 0.60%、3个月0.95% ± 0.65%、5个月1.33% ± 0.84%、7个月1.40% ± 0.48%），与未给予他莫昔芬时（0.93% ± 0.89%）相当，提示该低水平标记可能主要反映基线泄漏而非稳态下持续的胶质向神经元转化。

炎症性结肠炎后tdTomato⁺/Sox10⁺细胞定量：炎症后1个月，两种铺片中tdTomato⁺/Sox10⁺细胞比例仍保持高位（MP：DNBS 98% ± 1.3%、DSS 96.5% ± 2.0%；SMP：DNBS 97.9% ± 1.6%、DSS 97.8% ± 1.2%），与非炎症对照相当；肌层相关胶质细胞亦维持高水平标记（DNBS 99.3% ± 1.2%、DSS 98.9% ± 2.4%）。与对照相比，MP中tdTomato⁺/HuC/D⁺神经元比例在炎症条件下升高（对照0.94% ± 0.60%；DNBS 1.86% ± 1.1%；DSS 2.72% ± 1.2%），该升高与既往关于肠道炎症中胶质来源神经发生的报道一致，但也可能部分反映Cre^ERT2泄漏或炎症相关异位重组。

讨论与结论

研究人员指出，上述观察表明两次间隔48 h的急性他莫昔芬处理即可在Sox10⁺肠胶质细胞中诱导高效且持久的Cre介导重组后报告基因表达，这是目前对成年肠胶质细胞Sox10^CreERT2介导报告基因标记最长的随访，并首次描述黏膜下神经丛，扩展了既往约2个月的观察。结果直接回应了一项关键方法学问题：急性他莫昔芬给药是否足以长期维持高比例报告基因标记的Sox10⁺肠胶质细胞，抑或需反复给药以标记来自初始诱导时未重组细胞的新生胶质细胞。无他莫昔芬时存在的tdTomato阳性细胞提示基线Cre^ERT2泄漏，配体非依赖性重组在诱导型Cre^ERT2系统中被广泛报道，其程度因品系与构建设计而异；无他莫昔芬时重组水平显著低于诱导后水平，支持该模型用于肠胶质细胞诱导靶向的稳健性。高比例报告基因标记Sox10⁺胶质细胞的维持提示在所研究时间窗内标记细胞比例保持稳定；若新生细胞来源于已重组细胞或祖细胞，细胞更新未必稀释Sox10⁺谱系标记，而来自未标记群体的更新则可能逐步稀释标记，如既往成年ENS谱系追踪研究所示，因此该分析不能排除已标记胶质细胞的增殖或来自他莫昔芬给药时已重组祖细胞的更新。炎症后tdTomato阳性神经元比例升高与既往报道一致，但应谨慎解读。方法学上，该研究优化了Sox10^CreERT2模型在ENS中的应用：两次他莫昔芬注射即可实现高效诱导与持续表达，无需持续饮食给药或反复诱导，可减少潜在脱靶代谢或激素效应并简化实验设计；两种神经丛中报告基因表达的持久性支持该方法适用于肠胶质细胞功能的长期研究。作者亦承认若干局限：未采用Ki67或BrdU掺入等标志物直接评估细胞增殖，分析仅限于急性结肠炎模型；增殖标志物可能无法完全反映肠胶质细胞更新；未纳入黏膜肠胶质细胞分析；Sox10在成熟肠胶质细胞与祖细胞中均有表达，故稳定的报告基因表达可能反映长寿成熟胶质细胞或来自预重组祖细胞的更新；报告基因表达可能依赖报告构建本身，既往ENS谱系追踪研究报告了细胞类型依赖的报告基因表达差异及CAG驱动报告基因表达的变异性，故本研究观察到的稳定性在推广至其他报告构建时应谨慎；使用限于更分化胶质群体（如Gfap、S100b或Entpd2）的Cre驱动或在慢性炎症条件下是否可见类似稳定性仍有待确定。

研究结论：研究显示，他莫昔芬给药可在Sox10⁺肠胶质细胞中诱导高效且持久的报告基因表达，该表达在生理条件下可持续数月，在急性肠道炎症后可持续1个月。这些发现回应了关于Sox10^CreERT2遗传策略时间稳定性的关键技术问题，并支持其适用于肠神经系统长期报告基因研究。尽管结果未涉及肠胶质细胞更新程度，但表明Sox10^CreERT2介导重组后的报告基因表达可在较长时间范围内提供胶质细胞群的稳定读出。该工作为设计肠胶质细胞功能的长期研究建立了实用框架，并为未来研究肠神经系统内胶质可塑性、更新与衰老奠定基础。