《Microbiological Research》：Grapevine genotype and medium composition as drivers of culturable bacterial communities: From co-occurrence patterns to ISR against
Plasmopara viticola
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高通量流式细胞术揭示了源自根部的自然自建微生物群落（natural self-establishing microbial communities，NatComs）具有高度时间稳定性。在连续传代过程中，87.5%的NatComs保持了种群密度。宿主葡萄基因型是
高通量流式细胞术揭示了源自根部的自然自建微生物群落（natural self-establishing microbial communities，NatComs）具有高度时间稳定性。在连续传代过程中，87.5%的NatComs保持了种群密度。宿主葡萄基因型是群落组装的主要选择性驱动因素，抗性基因型（Voltis）与感病基因型（Chardonnay）组装出不同的核心细菌类群。经胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptic Soy Broth，TSB）培养的NatComs能够触发对葡萄霜霉病菌（Plasmopara viticola）的诱导系统抗性（induced systemic resistance，ISR）。
植物根系栖息着大量微生物，这些微生物在促进植物生长与增强抗病性方面发挥重要作用。土壤有益微生物或微生物联合体可通过拮抗病原菌和诱导寄主免疫发挥生物防治潜力，后者被称为诱导系统抗性（induced systemic resistance，ISR）。植物通过模式识别受体（pattern recognition receptors，PRR）感知微生物相关分子模式（microbe-associated molecular patterns，MAMPs），激活MAMPs触发免疫（MAMPs-triggered immunity，MTI），进而调控微生物定殖。然而，葡萄园微生物群落的实际结构及其在自然条件下对植物健康的作用仍不清楚。特别是由卵菌Plasmopara viticola引起的葡萄霜霉病，在高湿环境下可造成高达75%的产量损失，目前主要依赖化学杀菌剂防治。因此，利用有益微生物群落诱导ISR成为可持续农业的潜在策略。基于宏基因组测序可设计合成微生物群落（synthetic microbial communities，SynComs），但由于植物相关微生物多样性高且相互作用复杂，如何获得稳定且高效的群落仍是挑战。此外，绝大多数微生物在体外难以培养，限制了SynComs的构建。为此，研究人员提出一种基于自然自建微生物群落（natural self-establishing microbial communities，NatComs）的方法，通过将完整自然微生物群落在合成液体培养基中连续传代，降低复杂度并选择出相容的微生物组合。然而，目前尚缺乏对NatComs长期稳定性的系统性评估，传统扩增子测序成本高、周期长，难以用于动态监测。本研究旨在利用培养组学与流式细胞术相结合，从不同抗性葡萄基因型的根际分离并筛选稳定的NatComs，分析其群落组成，并评估其对P. viticola的诱导抗性效果。
研究人员从法国Chouilly香槟区同一葡萄园（未施化学药剂，砧木41B）采集感霜霉病品种Chardonnay和抗病品种Voltis的根际土壤、根面和内生部分样品，在不同培养基（LB、R2A、TSB、NM）中连续传代构建NatComs。通过流式细胞术评估稳定性，利用16S rRNA基因V3-V4区扩增子测序解析群落组成，并在葡萄植株上测定对P. viticola的诱导抗性。结果表明，多数NatComs在传代后期保持稳定；葡萄接穗基因型是驱动可培养群落组装的主要因素，两种基因型形成不同的核心细菌类群；部分NatComs显著降低霜霉病症状面积，其中TSB培养的群落效果最好。
主要关键技术方法包括：①流式细胞术结合SYBR? Green I染色，在传代第12～14天评估NatComs各细胞群的比例稳定性；②对稳定NatComs提取DNA后进行16S rRNA基因V3-V4区扩增子测序，用QIIME2流程（DADA2去噪）和Silva数据库进行ASV分类；③通过主成分分析（PCA）和置换多元方差分析（PERMANOVA）检验基因型、培养基、根际部分对群落组成的影响；④用相关分析揭示ASV共现模式；⑤在Chardonnay组培苗上，通过根部接种NatComs，10天后离体叶片接种P. viticola，测量孢子形成和病斑面积。样本队列来自上述单一葡萄园。
3.1 影响NatComs组成和定量稳定性的因素
通过流式细胞术分析，研究人员评估了不同来源和培养基条件下NatComs在传代第12～14天的稳定性。结果显示，所有已筛选的NatComs的群体平均标准差范围在0.33%～10.01%之间，平均振幅在0.63%～17.72%之间，表明大部分群落具有较高时间稳定性。培养基类型显著影响细胞浓度，R2A中细胞数最低，TSB中最高，但培养基丰富度并不影响稳定性或可分辨的群体数量。相比之下，来自根面和内生部分的NatComs稳定性略低，而来自根际土壤的群落更为稳定。
3.2 接穗基因型和培养基依赖的细菌NatComs组装：从16S rRNA谱到ASV共现模式
对24个最稳定的NatComs进行16S rRNA扩增子测序，共获得214个ASVs，归属于12个细菌属。每个NatCom平均含30个ASVs，平均4个属。其中来自Voltis内生部分在NM培养基中的群落仅含有Pseudomonas属，而Chardonnay内生部分在TSB中的群落最丰富，包含8个属。PCA分析显示，只有葡萄基因型对ASV组成存在显著影响，尽管前两个维度仅解释了24.7%的变异。进一步分析表明，Chardonnay来源的NatComs中常见Enterobacter和Serratia的稳定ASV组合，而Voltis来源的则富集Achromobacter、Pseudomonas和Serratia。此外，还发现了多个属间和ASV间的显著正负相关，如Pseudomonas与Enterobacter的负相关，以及特定Achromobacter ASV与Lysinibacillus ASV的正相关。
3.3 结合流式细胞术和高通量测序对微生物多样性的互补评估
研究人员尝试将流式细胞术的散点图与ASV组成关联。在少数情况下，一些共同散射特征可能对应Stenotrophomonas或Serratia等属，但在大多数情况下，流式细胞群无法直接对应到具体ASV。尽管如此，流式细胞术仍能快速反映群落复杂性，与测序结合可提高对合成群落中微生物多样性的解析能力。
3.4 培养基和根际部分影响葡萄来源NatComs对P. viticola诱导系统抗性的效果
在Chardonnay植株上，通过根部接种不同NatComs，6天后离体叶片接种P. viticola并统计孢子形成和病斑面积。结果显示，来自Chardonnay内生部分在R2A中（R2A_CNT_E）、根面在TSB中（TSB_CNT_R）以及根际土壤在TSB中（TSB_CNT_S）的NatComs显著降低了孢子密度。基于病斑面积，多个Chardonnay来源的NatComs（如R2A_CNT_S、TSB_CNT_S、TSB_CNT_R、NM_CNT_E）使病斑面积减少24.3%～38.4%；来自Voltis的若干NatComs也减少了8.4%～29.7%的病斑面积，但大部分效果弱于Chardonnay来源的优化群落。值得注意的是，所有在TSB中培养的NatComs都表现出显著的病斑面积降低，而LB中培养的群落均无效。
讨论部分指出，流式细胞术与16S metabarcoding的结合适用于评估简单群落，且能识别部分关键属。可培养NatComs的多样性受基因型影响大于培养基和根际部分，这与SynComs中初始微生物身份决定最终多样性一致。NatComs培养还提高了Serratia、Enterobacter、Rahnella等顽固菌的可培养性，说明微生物间的互作对可培养性至关重要。TSB培养基因其营养复杂性，可能促进了群落的功能协同，从而更有效地诱导ISR。最后，结论部分总结如下：本研究详细表征了来自葡萄基因型根际部分的不同稳定NatComs，提供了一种快速可重复的生物防治筛选途径。可培养NatComs的组成主要受葡萄接穗基因型而非培养基或根际部分驱动；Chardonnay来源的NatComs常见Enterobacter和Serratia，Voltis来源的常见Achromobacter、Pseudomonas和Serratia，有时伴有Stenotrophomonas、Lysinibacillus或Bacillus。这些稳定的群落可作为防治P. viticola的潜在生物防治资源。
