ROCK1中央卷曲螺旋结构域的同源区1（HR1）形成平行二聚体：全长ROCK的结构重建与动态寡聚化机制

《Communications Chemistry》：Structural and functional insights into the p160 Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase ROCK

　　

Rho相关蛋白激酶（ROCK1/2）是基础细胞过程的关键调控因子，也是多种病理特别是心血管疾病的重要治疗靶点。尽管末端球状激酶结构域和PH-C1串联体（PHn-C1-PHc）已被充分表征，但中央两亲性α-螺旋片段的序列-结构-功能关系仍知之甚少。研究人员采用整合生物物理学方法——包括多角度光散射（MALS）、分析超速离心（AUC）、小角X射线散射（SAXS）、负染电子显微镜（EM）、X射线晶体学及三维分子建模——阐明了ROCK1中央卷曲螺旋区的结构组织。值得注意的是，分辨率为2.2??的ROCK1同源区1（HR1）晶体结构揭示了一个典型的平行卷曲螺旋二聚体。这一结构排列与其他Rho效应激酶中发现的反平行卷曲螺旋HR1模块显著不同。结合全长ROCK1的结构重建，研究数据表明ROCK1的中央片段形成一个高度延长的卷曲螺旋二聚体。此外，对分离的全长卷曲螺旋结构域的EM分析揭示了其在二聚体和四聚体之间转换的动态寡聚化状态。总之，这些生物物理见解建立了一个基础，为未来研究ROCK1的调控、激活和下游信号传导机制开辟了途径。

研究背景与科学问题

Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK1/ROKβ/p160ROCK和ROCK2/ROKα/Rho激酶）是Rho家族小GTP酶的下游效应器，在Rho介导的应力诱导的肌动球蛋白骨架重排中发挥关键作用，调控细胞收缩、迁移、形态、极性、分裂及基因表达。越来越多的证据表明ROCK蛋白参与心血管疾病的不同阶段，包括脑和冠状动脉痉挛、心绞痛、高血压、肺动脉高压和心力衰竭，使其成为心血管医学中的重要治疗靶点。

ROCK蛋白共享一个位于N端的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域，随后是一个中央两亲性α-螺旋片段（全长卷曲螺旋，ROCK^FCC，氨基酸420-1100），以及C端被非典型C1结构域分隔的普列克底物蛋白同源（PH）结构域（PHn-C1-PHc）。ROCK^FCC包含N端同源区1（HR1）结构域、Rho相互作用结构域（RID）和Rho结合结构域（RBD）。此前，基于其他Rho效应激酶如PKN1的研究，ROCK^HR1被认为形成分子内反平行卷曲螺旋。然而，后续结构研究挑战了这一观点，提出ROCK可能处于一种组成型伸展构象，其激酶结构域远离质膜，这引发了关于Rho如何促进肌球蛋白激活的新问题。因此，阐明ROCK中央卷曲螺旋区域的真实结构和动态性质，对于理解其调控、激活及信号传导机制至关重要。

研究内容与结论

本研究采用整合生物物理学方法，系统研究了ROCK1（以下简称ROCK）中央两亲性片段的序列-结构-性质关系。通过对所有Rho效应器HR1结构域进行全面的序列分析，研究人员证明RhoA效应器分为两种不同的结构类别：PKN型和ROCK型HR1结构域。分辨率为2.2??的ROCK^HR1晶体结构揭示，与先前假设相反，ROCK型HR1模块形成一个真正的平行卷曲螺旋二聚体。结合覆盖中央卷曲螺旋片段的额外ROCK片段的生物物理数据，这些发现使研究人员能够重建全长ROCK（ROCK^FL）的综合结构模型。

主要关键技术方法

1. 1.
   X射线晶体学：用于解析ROCK^HR1（氨基酸420-550）的高分辨率（2.2??）三维结构。
2. 2.
   多角度光散射（MALS）与分析超速离心（AUC）：用于测定不同ROCK片段（HR1、FCC、CCC、RBD）在溶液中的绝对分子量和寡聚化状态。
3. 3.
   小角X射线散射（SAXS）：用于获取ROCK^HR1和ROCK^FCC在溶液中的低分辨率形状信息和几何参数（如回转半径Rg、最大粒径D_max）。
4. 4.
   负染电子显微镜（EM）：用于直接可视化ROCK^FCC和全长ROCK（ROCK^FL）的纳米级形貌和尺寸。
5. 5.
   三维分子建模：整合实验确定的各个结构域结构（激酶结构域、HR1、CC、SBD、RBD、PHn-C1-PHc），构建全长ROCK的复合结构模型。

研究结果

ROCK^HR1不同于PKN^HR1

通过远紫外圆二色光谱（far-UV CD）、MALS和AUC分析，研究发现ROCK^HR1形成稳定的二聚体，而PKN^HR1以单体和二聚体形式共存，RTKN^HR1则倾向于形成四聚体。这表明ROCK型和PKN型HR1序列对应着不同的四级结构。

ROCK^HR1是一个真正的平行卷曲螺旋二聚体

X射线晶体学解析的ROCK^HR1结构显示，它由两条长α-螺旋（188??）相互缠绕形成一个平行的双链卷曲螺旋二聚体，这与PKN^HR1的反平行结构截然不同。SAXS分析进一步证实了溶液中这种棒状颗粒的存在。

ROCK^HR1二聚体的表面呈现两亲性特征

通过计算伪疏水势能，研究确认了ROCK^HR1卷曲螺旋界面的两亲性：疏水残基位于螺旋间接触面，极性残基位于外部。

ROCK^HR1结构表现出不同的非典型七肽重复

TWISTER程序分析识别出十七个七肽重复，其中包含一个四氨基酸插入（“stutter”，SQNS），导致从左手到右手卷曲螺旋的转变。

高度延长的ROCK^FCC在二聚体和四聚体之间转换

SEC-MALS和AUC数据显示，ROCK^FCC存在二聚体（60%）、四聚体（16%）和更大聚集体的动态平衡。SAXS和EM分析进一步揭示了其细长的纤维样结构，长度在20-110 nm之间。

ROCK^FL揭示了一种平行的延长纤维样结构

EM分析纯化的ROCK^FL显示出一个约120 nm长的延长结构，两端分别带有激酶结构域和PHn-C1-PHc结构域的明显球状密度，支持全长ROCK形成平行二聚体的模型。

纯化的ROCK^FL表现出高活性

体外激酶实验表明，ROCK^FL对其天然底物MYPT1（肌球蛋白磷酸酶靶向亚基1）具有显著的磷酸化活性，且该活性可被ROCK抑制剂Y-27634完全抑制。然而，加入活化的RhoA并未进一步增强ROCK^FL的活性。

讨论与结论

本研究全面表征了跨越ROCK中央两亲性区域的不同片段（HR1、CCC、RBD、FCC）的物理和结构特性。通过整合计算生物信息学与一系列生物物理技术，绘制了这一信号支架的结构图谱。关键的是，ROCK^HR1的晶体结构揭示了其N端130个氨基酸形成一个平行卷曲螺旋二聚体。这一发现与PKN^HR1的反平行结构形成鲜明对比，将Rho效应器HR1结构域明确划分为ROCK型和PKN型两个结构类别。研究结果表明，ROCK^FCC整体形成一个约100 nm延长的卷曲螺旋二聚体，并能在二聚体和四聚体之间动态转换。全长ROCK的复合结构模型和EM观察一致地支持其作为一种高度延长的平行二聚体存在的模型，其两端分别为激酶结构域和PH-C1串联体。这些发现为理解ROCK的调控、激活以及下游信号传导机制提供了重要的结构基础，尤其为解释Rho如何与如此远离膜的激酶结构域相互作用以启动信号传导提出了新的视角。