《Genes & Immunity》：Novel genes and polymorphisms in human immunoglobulin light chains across diverse populations
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人类免疫球蛋白轻链基因座，即kappa（IGK）和lambda（IGL），是结构复杂的基因组区域，其种系基因内容尚未被完全阐明，并受到广泛复制和等位基因多样性的塑造，从而影响免疫功能。本研究利用两个高质量参考组装（GRCh38和T2T-CHM13），以及分别代
人类免疫球蛋白轻链基因座，即kappa（IGK）和lambda（IGL），是结构复杂的基因组区域，其种系基因内容尚未被完全阐明，并受到广泛复制和等位基因多样性的塑造，从而影响免疫功能。本研究利用两个高质量参考组装（GRCh38和T2T-CHM13），以及分别代表所有主要超级群体的142个和125个染色体水平单倍型组装，呈现了对IGK和IGL的全面IMGT注释。对每个基因座中两个组装的详细审编鉴定了5个新型IGKV基因（3个功能性，2个假基因）、8个IGKV等位基因（3个功能性，5个假基因）、1个新型IGKJ（ORF）等位基因、16个新型IGLV基因和22个新型IGLV等位基因（均为假基因），这些均通过reads比对、在全基因组测序数据集中的存在以及在组装间的重现性得到验证。研究评估了整个队列中的结构变异和基因存在/缺失模式。IGL显示高度保守性，仅观察到1个基因的反复缺失，而IGK表现出更大的变异性，包括远端区域的完全缺失。这种结构多样性使研究人员能够绘制跨祖先群体的潜在基因存在/缺失模式。本研究细化了IGK和IGL的结构分辨率，扩展了IMGT参考集，为研究抗体库、免疫遗传变异、单克隆抗体开发和群体水平多样性提供了改进的框架。
**研究背景与问题**
人类免疫球蛋白轻链由kappa（IGK）和lambda（IGL）两个基因座编码，与重链（IGH）共同构成免疫球蛋白（IG）的抗原结合位点，影响抗体的特异性、亲和力和分子特征。尽管轻链在免疫中发挥核心作用，IGK和IGL基因座的基因组结构和种系基因内容仍未完全解析，尤其是跨多样人群的结构变异和多样性方面存在显著知识空白。与单一的IGH基因座不同，轻链基因分布于两个不同的染色体区域：IGK位于2p11.2，IGL位于22q11.2。IGK基因座具有独特的组织结构，包含两个大型、倒置、高度相似的IGKV簇，其后为J-C基因；靠近J-C基因的簇称为近端簇，较远的称为远端簇。IGL则呈现IGLV基因的串联排列，其后为J-C簇。两个基因座均以V基因间和J基因间的高度序列相似性以及广泛的等位基因多样性为特征，这为准确的基因组组装和注释带来了巨大挑战。GRCh38等参考基因组仅捕获了IGK和IGL基因座的部分区域，基因间的高度相似性使准确组装和变异检测尤为困难，IGK中大型重复区域更增加了额外的复杂性层面。此前很少有研究旨在发现IGK和IGL中的新多态性、拷贝数变异和结构变异，在多样背景个体中进行大规模研究以评估遗传多样性和潜在模式的研究则更少。长读长测序和单倍型解析基因组组装的最新进展为重新审视这些区域提供了强大平台。IMGT作为国际免疫遗传学信息系统，提供了基因分类、功能性和命名的综合框架，支持跨基因组的标准化注释和交叉比较。在此背景下，研究人员开展了本项研究，旨在利用大规模多样人群组装数据，全面分析IGK和IGL基因座的基因内容、等位基因多样性和结构变异，扩展IMGT参考目录，为抗体库研究、群体免疫遗传学和免疫基因组多样性提供改进的框架。
**关键技术方法**
研究人员采用IMGT生物审编流程进行分析，该流程整合了人工审编与IMGT/LIGMotif、NtiToVald和IMGT/Automat等内部软件工具，基于IMGT-ONTOLOGY的公理和概念确保注释的准确性和一致性。从NCBI检索了截至2025年7月15日所有554个公开可用的人类染色体组装，根据所含目标染色体（IGK为2号染色体，IGL为22号染色体）进行过滤，排除部分序列、抑制或二倍体状态的组装。最终IGK分析纳入144个高质量单倍型组装，IGL分析纳入127个高质量组装，代表非洲（AFR）、混合美洲（AMR）、东亚（EAS）、欧洲（EUR）和南亚（SAS）所有主要超级群体。使用Minimap2（v2.24-r1122）将HiFi长读长数据比对至各基因座区域，通过IMGT/StatAssembly（v1.0.4）评估基因座质量。新基因和等位基因通过多步评估框架验证：IMGT/StatAssembly分析BAM比对以评估reads支持，要求外显子区域100%一致性全覆盖、每个核苷酸支持reads数>10且匹配率>80%；同时通过BLAST+（v2.16.0）与NCBI wgs和nt数据库交叉验证，并与OGRDB种系集和VDJbase基因组数据集进行比较。基因存在/缺失分析使用CD-HIT（v4.8.1）以98%一致性聚类代表序列，通过Minimap2（v2.27）以短读长设置比对，采用保守过滤阈值（最低70%基因覆盖率和80%序列一致性）生成二值存在/缺失矩阵，并以BLASTn使用延伸序列进行验证。所有统计和可视化分析使用Python及标准科学库完成。
**研究结果**
*高质量组装数据集的审编与组成*：截至2025年7月15日，NCBI共有554个人类染色体组装。IGK分析中，362个组装因含2号染色体被保留，排除65个因NCBI注释状态为部分、抑制或二倍体的组装；在362个初选组装中，162个被标记为重排或潜在重排（通过IMGT/V-QUEST确认VJ重组模式），因IGK倒置重复区域使重排解释复杂而排除；53个因不符合IMGT标准被移除；4个组装完全缺失IGK基因座；2个因来自同一体被去除。最终数据集包含144个高质量种系组装，其中140个代表所有主要超级群体，2个缺乏祖先元数据。IGL分析中，412个组装被排除（361个缺失22号染色体，60个因注释状态），剩余133个单倍型组装中仅41个定位于预期染色体范围（21–24 Mb），1个完全缺失基因座；最终127个高质量组装代表所有主要超级群体（29个AFR、17个AMR、35个EAS、7个SAS、27个EUR），12个缺乏祖先元数据，其中6个含重排基因座（来自B淋巴细胞系），因其在捕获体细胞VJ重组生物学阶段的相关性而保留。
*IGK基因座新基因和等位基因的综合注释*：通过对T2T-CHM13v2.0（IMGT000281）和NA19240_mat_hprc_f2（IMGT000273）两个组装的完整注释，鉴定出5个新型IGKV基因（3个功能性，2个假基因）。其中一个新型功能性基因对应先前未定位的IGKV1-NL1，检测到位于IGKV3D-7和IGKV1D-8之间，与先前研究一致，已重命名为IGKV1D-7-1。另外两个新型功能性基因IGKV1-40-1及其重复倒置的IGKV1D-40-1分别位于IGKV2-40上游和IGKV2D-40下游，确认了先前研究，这些基因在GRCh38中缺失，可能源于测序错误，现已完整注释。此外鉴定出2个新型重复基因：近端区域的IGKV(II)-26-1（位于IGKV2-26和IGKV1-27之间）及其远端重复IGKV(II)D-26-1*01（位于IGKV2D-26和IGKV1D-27之间）。对两个IGK基因座的综合分析鉴定了现有IGKV和IGKJ基因内的9个等位基因，包括8个IGKV（3个功能性，5个假基因）和1个IGKJ（1个ORF）等位基因。与现有文献比较显示，3个功能性IGKV等位基因与Engelbrecht等近期报道的序列一致，独立研究和不同方法间的鉴定为这些等位基因的存在提供了额外验证。所有新基因和等位基因均已在IMGT000273和IMGT000281中完整注释，被视为高置信度，得到测序reads数据支持并在NCBI wgs数据集中多个个体中发现。
*IGK基因座跨群体和祖先背景的结构与基因变异*：在144个组装中，IGK基因座显示高度保守的基因内容和组织。最普遍的结构变异是新基因IGKV1D-7-1的插入，位于IGKV3D-7和IGKV1D-8之间，在30个组装中检测到，114个缺失。频率跨超级群体变化：EUR 5.5%（1/22）、SAS 12.5%（3/24）、AMR 10.7%（3/28），而AFR和EAS频率更高，分别为31.4%（11/35）和35.5%（11/31）。成对Fisher精确检验显示，AFR和EAS组装携带IGKV1D-7-1的可能性显著高于EUR，EAS也高于AMR；AFR与AMR及EAS与SAS之间的比较未达统计学显著性（p≈0.07），可能反映样本量有限。在5/144个组装中观察到涉及IGK远端区域完全缺失的大规模结构变异（2个EUR、1个AMR、1个EAS、1个SAS），在这些单倍型中IGKV1D-40-1是唯一保留的远端可变基因，定义了缺失区域的末端。此外，在单个组装（CM087187.1）中观察到近端IGK区域的罕见大缺失，IGKV2-29至IGKV1-5基因在所有应用方法中均缺失。最后，在近端区域观察到一系列重叠缺失，共享相同的下游终点IGKV6-21基因，但上游起点可变（CM087317.1中为IGKV1-27，CM086975.1中为IGKV2-26，CM089428.1中为IGKV2-23）。这些区域未发现组装gap，相应基因在所有方法中均未检测到，提示真实结构变异或潜在测序伪影。
*不同祖先高质量组装数据集的IGL基因座注释与新基因发现*：对两个参考组装和125个额外高质量单倍型组装（IMGT000225和IMGT000280）的注释鉴定出16个新型IGLV基因。对两个参考基因座的综合注释还揭示了现有IGLV基因内的22个新等位基因，均为假基因。新基因在数据集中一致鉴定，大多数几乎存在于所有组装中；少数情况下的缺失（以星号标记）归因于体细胞重排，掩盖了这些组装中的原始种系构型。所有16个新基因在两个参考序列中均有注释及相应等位基因，并得到NCBI nr/nt或wgs中一个或多个个体存在的支持。
*IGL基因座跨群体的基因变异和基因存在/缺失模式*：在127个组装中，IGL基因座的总体基因内容和组织高度保守，大多数偏差代表个体案例而非系统性群体特异性模式。然而，一个亚组5可变基因IGLV5-39在75/127个组装中表现反复缺失。尽管IGLV5-39是功能性基因，但在大量组装中缺失；在52个组装中确认其存在，一致定位于IGLV(I)-42和IGLV(VII)-41-1之间。成对Fisher精确检验未达统计学显著性（p>0.05），表明虽然观察到群体间IGLV5-39存在的差异，但在当前样本量下无法确认。在特定个体中检测到额外变异：个体HG00544（南方汉族，CM089381.1）的父源组装缺乏11个连续的IGLV3和IGLV2亚组基因及克隆（IGLV3-21至IGLV2-14），该区域无序列gap（约9.3 kb），提示可能的结构缺失，而母源组装未显示此缺失。NA20850（古吉拉特印度人，CM094315.1）中IGLV4-60和IGLV11-55之间7个基因缺失，跨度13 kb，而参考基因组中为52 kb。对恒定区的检查确认了潜在拷贝数变异（CNV），多个组装显示J-C簇重复（如J2-C2或J3-C3）以及仅涉及J2-C2的三重复（如CM092025.1）。IGLC2和IGLC3因序列高度相似（99%）而难以区分，例如CM101478.1（NA18970，未知祖先，地理起源日本）和CM101699.1（NA18943，日本人）中鉴定出三个IGLC2*02拷贝而无IGLC3存在，可能提示与IGLC2序列相同的IGLC3变异。其他组装（如CM009893.1，南方汉族）显示整个J2-C2/J3-C3块重复，连接区和恒定区序列近乎相同。对部分组装的人工验证确认了重复或三重复恒定基因的存在，支持IGL恒定区潜在CNV的发生，这些构型与先前靶向长读长测序研究中描述的J-C重复案例一致。
*短读长比对与BLASTn基因检测的比较*：Minimap2（v2.27）比对代表性基因序列成功检测了组装中大多数免疫球蛋白基因，而BLASTn使用较长参考序列确认了这些结果并恢复了少数Minimap2遗漏的基因。例如IGK基因座中，组装CM086905.1的IGKV3-7未被SR比对检测到但被BLAST捕获；IGKJ1、IGKJ2、IGKJ4和IGKJ5被两种方法一致检测到，而IGKJ3仅被BLAST鉴定。总体而言，这种组合方法突出了SR比对高置信度检测和BLAST在挑战性区域增加灵敏度的互补优势。共享个体的高一致性进一步支持了SV检测流程的可靠性：NA21110（IGK）和HG01106（IGL）在先前研究中的基因内容和单倍型结构与本研究数据集完全一致。
**讨论与结论**
对IGK和IGL基因座跨多个人类组装的全面的分析揭示了复杂的遗传变异格局，包括新基因、等位基因多态性和结构变异。IMGT位置命名法对于确认基因存在和区分不同等位基因至关重要，确保了基因注释的一致性和准确性。跨多样人群的这些基因座检查揭示了基因存在和频率的差异，提供了轻链免疫球蛋白库群体特异性结构的见解。本研究据研究人员所知是迄今研究人类IGK（n=144）和IGL（n=127）基因座结构变异和群体水平差异的最大数据集。然而，当前亚群体样本量尚未穷尽，这些发现应被视为轻链多样性的基础性特征描述，进一步数据对于捕获罕见变异和全面表征群体特异性差异至关重要。在基因存在/缺失评估中，研究人员采用了两种互补方法：Minimap2（-x sr）比对短IG序列和BLASTn比对较长参考序列，结果表明Minimap2比对为大多数基因提供了快速高置信度检测，BLAST成功恢复了少数遗漏的短J基因，强调了短序列和长序列比对方法结合用于免疫球蛋白基因座全面表征的互补性。
关于IGK基因座，先前研究认为IGK基因座基本完整且注释准确，但本研究通过IMGT生物审编流程对2个单倍型组装的分析鉴定了5个先前未报道的IGKV基因和8个新等位基因（3个功能性，5个假基因），结合近期关于额外IGK多态性的报道，表明IGK基因座可能仍存在未发现的变异，尤其是在纳入多样祖先背景基因组时。在新鉴定的等位基因中，IGKV2D-40*02值得特别关注，该基因已被报道为肌腱愈合和静脉血栓形成的候选生物标志物，并与头颈部鳞状细胞癌和结直肠癌的预后相关，具有免疫治疗靶点的潜力。虽然IGKV2D-40*02多态性的功能后果尚待确定，但该基因的变异可能影响蛋白质功能、免疫调节和疾病结局。类似地，研究人员在IGKV2D-28中鉴定了一个新SNP（IGKV2D-28*02），先前被报道为妊娠期糖尿病（GDM）的潜在生物标志物。该SNP可能影响基因活性和表达；值得注意的是，IGKV2D-28出现在许多急性髓系白血病患者的复发性IGK重排模式中，提示该基因在白血病相关库中的非随机参与。除单核苷酸变异外，结构变异也贡献于IGK多样性。远端区域对应IGKV1D-7-1的SV插入在约30个组装中检测到，确认了先前报道。结果突出了IGKV1D-7-1跨群体的可变存在，AFR和EAS组装频率高于EUR、SAS和AMR，提示群体特异性结构变异贡献于IGK多样性。成对比较确认AFR和EAS基因组携带IGKV1D-7-1的可能性显著高于EUR，EAS高于AMR；其他比较未达统计学显著性，可能反映这些群体样本量有限。此外，在5/144个组装中观察到涉及IGK远端区域完全缺失的罕见SV，先前已有报道，该缺失导致多个远端IGKV基因丢失，可能降低受影响个体的IGK库多样性。最后，在个体组装中检测到几个推定的SV缺失，可能代表IGK基因座内的罕见SV。特别值得注意的是三个缺失案例共享共同模式：虽然上游边界不同导致丢失3、6或8个基因，但均一致终止于同一基因IGKV6-21。鉴于IGK基因座的重复性质，不能完全排除测序或组装伪影，但无gap、其余基因顺序一致以及在独立组装中反复观察到类似缺失模式，可能提示IGKV6-21基因附近存在潜在基因组热点和真实结构变异，需要在更大数据集中进一步验证。
关于IGL基因座，本研究提供了使用127个多样人群单倍型组装（包括GRCh38和T2T-CHM13）的人类IGL基因座的更新和全面表征。通过两个参考组装的IMGT生物审编流程，鉴定了16个新IGLV基因和22个新等位基因，均分类为假基因，扩展了已知IGL种系库。IGL基因座通常跨度22号染色体21–24 Mb，位于富含片段重复和低拷贝重复的结构复杂区域，因此在若干单倍型组装中IGL基因座出现移位、碎片化或缺失，可能反映真实结构变异和重复富集或GC偏好区域基因组组装固有技术限制的组合。新条目中IGLV(I)-34-1和IGLV(I)-34-2位于先前描述的IGLV7-35和IGLV2-34之间11.9 kb基因间区域，研究人员确认该插入跨度约12.9 kb，包含两个假基因，在大多数组装包括参考基因组中一致存在。先前未定位的IGLV2-NL1现命名为IGLV2-34，已在所有未重排基因座中完整注释和观察到。若干先前模糊或表征不足的IGL基因在本研究中得到阐明：IGLJ6先前疑似假基因，在几乎所有组装中鉴定到并在IMGT数据库中一致注释为功能性；IGLV3-12、IGLV3-22和IGLV4-3在转录组研究中频率较低，但在基因组水平一致存在，支持其纳入种系库。相反，IGLV5-39在数据集中代表性有限，与先前关于亚组5多态性插入、缺失或高度分化片段的报道一致。在数据集中，研究人员确认了所有IGLV亚组的存在，包括表征较少的IGLV9（IGLV9-49）和IGLV10（如IGLV10-64），以及临床相关基因IGLV1-44、IGLV6-57和IGLV2-23的一致存在。值得注意的是，与AL淀粉样变性相关的IGLV6-57在129个组装中发现，支持其一致的种系存在。与先前发现一致，IGL基因座显示相对较低的等位基因多样性，尤其是与非常复杂的IGH相比，表明轻链多样性受到更严格的进化约束以降低自身反应性风险。新出现的证据表明IGLJ和IGLC基因的结构变异比先前认识的更为普遍，本研究观察到IGLC2和IGLC3重复以及符合J2-C2或J3-C3块重复的构型，这些观察在多样祖先中检测到，与先前在日本、突尼斯、黎巴嫩和非洲人群中的发现一致，可能反映具有潜在表达水平效应的历史重组事件。完善的IMGT IGL参考集对免疫遗传学和临床研究具有重要意义，因为此类变异贡献于抗体多样性和对恶性和感染性疾病的易感性。
总之，对IGK和IGL基因座的分析揭示了先前未认识的等位基因和结构变异，强调了多样人群数据集在捕获免疫遗传多样性全谱方面的价值。扩展的单倍型组装队列用于鉴定基因存在/缺失模式并支持新鉴定基因和等位基因的重现性。研究结果强调了新种系变异在增强库分析中的影响，并提供了研究癌症、自身免疫和新兴感染中IG变异遗传基础的框架，从而增进了对抗体多样性、免疫调节和疫苗反应性的理解。未来整合高质量多样组装和功能数据的研究对于全面理解轻链多样性对人类健康的贡献至关重要。
