仿生杂化膜纳米反应器通过双催化增强活性氧扩增与cGAS-STING激活实现肝细胞癌深部光动力免疫治疗

《Advanced Functional Materials》：Biomimetic Hybrid-Membrane Nanoreactor for Deep-Seated Photodynamic Immunotherapy of Hepatocellular Carcinoma via Dual Catalysis-Enhanced ROS Amplification and cGAS-STING Activation

　　

光动力疗法（PDT）在对抗肝细胞癌（HCC）方面颇具前景。然而，其针对深部HCC的疗效受到有限的光穿透深度、瘤内缺氧以及不足的系统性抗肿瘤免疫力的严重限制。在此，研究人员开发了一种高度集成的仿生自供氧纳米反应器UCNP@MnOx-Hyp@HRM（简称UMHM）。UMHM包被有由Hepa1-6肿瘤细胞/红细胞融合而成的杂化膜，可实现同源肿瘤靶向和免疫逃逸，确保纳米颗粒在深部肿瘤中的有效积累。二氧化锰壳层可催化H2O2分解，原位生成氧气以缓解缺氧并改善上转换纳米颗粒介导的PDT疗效，同时PDT/化学动力学疗法（CDT）协同放大氧化应激并诱导免疫原性细胞死亡（ICD）。至关重要的是，ICD释放的胞质双链DNA与Mn2+协同作用，激活cGAS-STING通路。该信号通路与ICD共同促进树突状细胞成熟和细胞毒性T淋巴细胞募集，并重塑免疫抑制性肿瘤微环境。在体内，UMHM在大体积皮下HCC模型中实现了86.4%的肿瘤生长抑制率，并在原位HCC模型中有效抑制了肿瘤进展。此外，UMHM诱导了显著的远隔效应，抑制了远处肿瘤和肺转移灶的生长。本研究为深部实体瘤的光动力免疫治疗提供了一种新颖且多功能的协同策略。

论文解读

研究背景与目的

肝细胞癌（HCC）是全球高发的恶性肿瘤，多数患者确诊时已处于中晚期，失去手术机会。光动力疗法（PDT）作为一种局部肿瘤治疗手段，具有时空可控、微创、低全身毒性等优势，并能诱导免疫原性细胞死亡（ICD），发挥“原位疫苗”作用。然而，传统PDT在治疗深部HCC时面临三大瓶颈：一是紫外/可见光组织穿透深度有限，导致深部肿瘤区光剂量不足，活性氧（ROS）产量显著降低；二是HCC固有的乏氧和免疫抑制微环境限制了单线态氧的产生；三是局部单一PDT难以激发强效的系统性抗肿瘤免疫应答。为克服这些障碍，亟需在一个纳米系统中协同整合高效递药、逆转乏氧和系统性免疫激活机制。

研究方法概述

研究人员设计并制备了一种核-壳-膜三元结构的仿生自供氧纳米反应器UMHM。关键技术包括：采用热分解结合一锅连续层层外延法合成Nd³⁺敏化的β-NaYF₄:20%Yb,2%Er@β-NaYF₄:20%Nd核壳结构上转换纳米颗粒（UCNPs）作为光转换核心；通过聚乙烯亚胺（PEI）介导的高锰酸钾温和还原，在UCNPs表面原位沉积混合价态二氧化锰（MnO_x）壳层，并物理吸附负载光敏剂金丝桃素（Hyp）；利用挤出法制备由Hepa1-6肿瘤细胞膜与红细胞膜融合而成的仿生杂化膜（HRM），并包裹于纳米颗粒表面。该平台利用UCNPs将穿透力强的808 nm近红外光转换为可见光，激活Hyp产生PDT效应；MnO_x壳层在肿瘤微环境（TME）中响应降解，发挥过氧化氢酶样活性产氧缓解乏氧、类芬顿反应启动CDT以及释放Mn²⁺作为天然免疫佐剂三重功能；HRM则赋予纳米颗粒同源肿瘤靶向与免疫逃逸双重能力。

研究结果

2.1 UMHM的构建与功能表征：透射电镜、动态光散射、X射线衍射、傅里叶变换红外光谱及X射线光电子能谱等表征证实成功制备了UCNP@MnO_x-Hyp@HRM核-壳-膜纳米结构。HRM融合效率验证显示两种膜组分高度共定位，并保留了CD47蛋白和同源靶向识别能力。荧光共振能量转移实验证实UCNPs与Hyp之间存在高效能量传递（545 nm通道效率35.3%，650 nm通道效率41.9%）。电子顺磁共振波谱证明UMHM在808 nm照射下可产生¹O₂，并在模拟TME中催化产生·OH。药物释放实验表明UMHM在生理条件下稳定，而在酸性含H₂O₂的TME中72小时内累积释放87.3%的Hyp和约60%的Mn²⁺。

2.2 UMHM的细胞摄取与体外PDT/CDT协同治疗：共聚焦显微镜和流式细胞术显示，HRM修饰使UMHM在Hepa1-6细胞中的摄取效率显著提高（240分钟达84.2%），而对正常肝细胞AML12的摄取极低，表现出选择性靶向。三维多细胞肿瘤球体穿透实验证明UMHM可渗透至120 μm深度。CCK-8实验显示，UMHM联合808 nm激光处理在常氧和乏氧（1% O₂）条件下细胞活力分别降至27.3%和41.2%，IC₅₀为0.73 μg/mL。乏氧探针和HIF-1α染色证实MnO_x有效缓解了缺氧。DCFH-DA染色显示UMHM+L组ROS水平最高（阳性率76.9%）。活死细胞染色进一步验证了其在乏氧条件下的高效杀伤能力。

2.3 UMHM诱导的氧化应激与凋亡：EdU染色显示UMHM+L组DNA合成被显著抑制，EdU阳性细胞降至对照组的约10%。谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）比值降至对照组的35.5%，表明GSH耗竭。JC-1染色证实线粒体膜电位崩溃。Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术显示UMHM+L组总凋亡率达68.2%。

2.4 UMHM激活ICD-STING免疫通路并诱导DC成熟：Western blot证实UMHM+L组STING、TBK1和IRF3磷酸化水平显著升高。胞质双链DNA（dsDNA）泄漏增加，细胞内cGAMP水平上调。ICD标志物检测显示细胞外ATP释放增加至PBS组的3.88倍，钙网蛋白（CRT）暴露和HMGB1核转位明显。使用STING特异性拮抗剂H-151后，树突状细胞（DC）成熟率从46.2%骤降至19.2%，IFN-β分泌受抑，证明Mn²⁺增强的cGAS-STING通路是不可或缺的驱动因素。骨髓来源DC共培养实验显示UMHM+L组CD11c⁺CD80⁺CD86⁺成熟DC比例达33.4%。

2.5 UMHM的体内靶向与深部肿瘤治疗效果：活体成像显示UMHM在肿瘤部位蓄积峰值出现在注射后8小时，循环半衰期延长至9.12小时。在大体积皮下HCC模型（~360 mm³）中，UMHM+L组肿瘤生长抑制（TGI）率达86.4%，远高于常规PDT组。组织学分析显示广泛肿瘤坏死、Ki67增殖减少、CRT暴露增加、HMGB1核信号减弱、γ-H2AX和p-STING荧光增强。在原位HCC模型中，MRI和H&E染色证实UMHM+L有效抑制了肝内肿瘤进展。血清ELISA显示IFN-β、TNF-α和IFN-γ水平显著升高。

2.6 UMHM诱导的系统性抗肿瘤免疫应答：在双侧皮下肿瘤模型中，UMHM+L不仅抑制了接受照射的原发肿瘤（TGI 78.6%），还显著抑制了未照射的远端肿瘤（TGI 82.2%）。引流淋巴结中成熟DC比例达42.8%。流式细胞术显示原发和远端肿瘤中CD3⁺CD8⁺细胞毒性T细胞浸润均显著增加（分别达30.9%和30.4%），M1/M2型肿瘤相关巨噬细胞比值分别提高6.97倍和6.29倍，调节性T细胞（Tregs）比例显著下降。脾脏中效应记忆T细胞（T_em）比例升至对照组的3.96倍。在肺转移模型中，UMHM+L组肺部转移结节数量大幅减少，脾脏T_em比例达28.5%。

总结与结论

本研究成功构建了一种仿生自供氧纳米反应器UMHM，在单个纳米系统中启动了深部肿瘤蓄积与激活、治疗作用和免疫应答的多阶段协同级联，克服了深部HCC光动力免疫治疗的多个瓶颈。具体而言，HRM协同整合了免疫逃逸和同源靶向功能，确保了药物向深部病灶的可靠递送。UCNP驱动的深部组织PDT与MnO_x原位产氧相结合，缓解了PDT疗效受限的问题，而类芬顿CDT则协同放大了局部氧化应激。此外，ICD促进dsDNA释放至胞质，与TME响应释放的Mn²⁺协同强效激活cGAS-STING通路，该通路作为核心免疫放大器，与ICD协同诱导了强大的系统性抗肿瘤免疫应答。体外和体内实验证明，这种多重协同治疗策略能够重塑免疫抑制微环境，有效抑制原发深部肿瘤、远处肿瘤和肺转移。尽管本研究基于单一小鼠HCC模型且样本量有限，但该仿生纳米平台为深部实体瘤的光动力免疫治疗提供了新的见解，相关成果发表于《Advanced Functional Materials》。