《Journal of Radiation Research and Applied Sciences》：Cross-stressor mouse liver transcriptomics and cortisol-treated HepG2 cells reveal stressor-dependent oxidative-phosphorylation responses and GR/FOXO3/PPARγ-associated changes
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背景/目的：慢性应激激活下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴），使肝脏反复暴露于糖皮质激素信号，但不同应激范式下的肝脏转录响应可能存在差异，不能假定其能反映肝细胞来源细胞的直接响应。本研究整合应激源特异性小鼠肝脏转录组学与皮质醇暴露的HepG2实验，以表征反复出现
背景/目的：慢性应激激活下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴），使肝脏反复暴露于糖皮质激素信号，但不同应激范式下的肝脏转录响应可能存在差异，不能假定其能反映肝细胞来源细胞的直接响应。本研究整合应激源特异性小鼠肝脏转录组学与皮质醇暴露的HepG2实验，以表征反复出现及情境依赖的转录变化，并检验糖皮质激素受体（GR）和FOXO3扰动是否减弱特定的皮质醇相关细胞表型。方法：19份批量RNA测序样本以DESeq2进行三项独立对比分析。跨应激源反复性通过范式特异性效应方向及错误发现率（FDR）进行描述性总结。HepG2细胞暴露于终浓度1、5、10 μM皮质醇，另设RU486预处理组或FOXO3靶向小干扰RNA（siRNA）后10 μM皮质醇组。终点包括CCK-8细胞脱氢酶活性、Annexin V/碘化丙啶（PI）阳性率、细胞外ATP及选定的GR/FOXO3/PPARγ相关蛋白。结果：束缚应激、社会挫败应激和足底电击应激分别产生2,246、874和1,610个显著保留的计数矩阵特征。Fkbp5在全部三项对比中均升高，而Pparg仅在束缚应激后达到FDR显著性。氧化磷酸化转录富集在束缚应激和足底电击应激后为正向，在社会挫败应激后为负向。在HepG2细胞中，皮质醇与CCK-8信号及细胞外ATP的浓度相关性降低以及凋亡比例增加相关。皮质醇还与PPARγ、PGC-1α、TFAM和COX IV丰度降低及磷酸化FOXO3/总FOXO3比值降低相关。RU486预处理和FOXO3靶向siRNA部分减弱了其中若干变化。结论：小鼠肝脏数据识别出反复出现的糖皮质激素响应性转录及应激源依赖性代谢程序，包括分化的氧化磷酸化和Pparg响应。HepG2实验提供了互补的细胞层面证据，其中皮质醇相关的功能和蛋白变化在GR拮抗或FOXO3靶向后部分减弱。这些发现支持GR/FOXO3/PPARγ相关参与，同时保留跨应激源肝脏转录与药理学细胞培养响应之间的区分。
**研究背景与问题**：慢性心理应激是一种系统性代谢挑战，反复激活下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴），增加外周器官的糖皮质激素暴露。肝脏协调葡萄糖、脂质、氨基酸及外源物代谢，必须整合内分泌应激信号与底物再分配及长期转录适应。肝细胞对能量需求变化尤为敏感，因为线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）为生物合成、解毒和氧化还原稳态维持提供ATP。反复糖皮质激素暴露可通过直接受体信号和全身生理的继发变化影响肝脏代谢，使肝脏响应的方向和幅度依赖于实验情境。束缚应激、社会挫败应激和足底电击应激在心理显著性、体力需求、交感激活、摄食行为和恢复模式上存在差异，将这些范式合并为单一应激组可能掩盖具有生物学意义的异质性。糖皮质激素受体（GR）、叉头框O3（FOXO3）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）构成一个生物学上合理的调控网络，可用于检验上述关系。GR激活诱导经典糖皮质激素响应基因如Fkbp5；FOXO3活性受磷酸化依赖性亚细胞定位影响，可修饰代谢和氧化应激转录；PPARγ和PPARγ共激活因子1-α（PGC-1α）参与线粒体和脂质代谢基因程序；线粒体转录因子A（TFAM）支持线粒体DNA转录，细胞色素c氧化酶亚基IV（COX IV）是呼吸链复合体IV的组分。公开资源GSE228579包含多种应激范式的批量肝脏RNA测序图谱，本研究有意聚焦于非肿瘤批量肝脏对照、束缚、社会挫败和足底电击样本，以便在三种应激范式下评估同一生物学问题而不混入荷瘤、遗传操作或单核样本。
**研究内容与结论**：研究人员将小鼠肝脏分析与皮质醇处理的HepG2实验视为跨物种和实验系统的互补证据层。目的为表征反复出现及应激源依赖的肝脏转录响应，并确定GR拮抗或FOXO3靶向是否减弱HepG2细胞读数及选定PPARγ相关蛋白中皮质醇相关变化。结论为：小鼠肝脏数据识别出反复出现的糖皮质激素响应性转录及应激源依赖性代谢程序，包括分化的OXPHOS和Pparg响应；HepG2实验提供互补细胞层面，皮质醇相关功能和蛋白变化在GR拮抗或FOXO3靶向后部分减弱；这些发现支持GR/FOXO3/PPARγ相关参与，同时保留跨应激源肝脏转录与药理学细胞培养响应之间的区分。重要意义在于定义一个分层应激响应框架，其中反复糖皮质激素响应性转录与下游肝脏代谢程序中的显著情境依赖性共存。
**关键技术方法**：研究整合公共小鼠肝脏批量RNA测序数据（GEO登录号GSE228579，选取19份非肿瘤批量肝脏样本：对照4份、束缚应激5份、社会挫败应激6份、足底电击应激4份；来源为C57BL/6J小鼠，以雄性为主，8-16周龄）的二次分析与HepG2细胞实验。转录组分析采用DESeq2进行范式特异性差异表达分析（Wald检验，Benjamini-Hochberg FDR<0.05），并行基因集富集分析（GSEA）及Hallmark通路评分。细胞实验采用CCK-8脱氢酶活性检测、Annexin V-FITC/PI流式细胞术凋亡检测、细胞外ATP发光法检测、Western blot及免疫荧光分析。
**研究结果**：
3.1 全局肝脏转录组结构与研究组：主成分分析（PCA）显示社会挫败样本部分分离，而对照、束缚和足底电击样本存在重叠；三种对比的显著计数矩阵特征数目不同，仅作描述性报告。
3.2 应激源特异性表达重塑与保守糖皮质激素响应：在FDR<0.05下，束缚应激产生1,056个上调与1,190个下调特征，社会挫败产生499个上调与375个下调特征，足底电击产生790个上调与820个下调特征。Fkbp5在三项对比中均显示正向log2倍数变化（束缚3.16、社会挫败3.49、足底电击3.09），此反复方向与糖皮质激素响应性转录一致，但不单独确立持续性肝脏GR激活。
3.3 描述性跨应激源整合识别反复糖皮质激素响应与应激源依赖性候选轴：方向感知整合识别出许多具有重复效应方向的特征。Fkbp5在三种范式中均为正向；Pparg仅在束缚应激后显著降低（log2倍数变化?1.00，FDR=9.96×10
?5），在社会挫败或足底电击后未达FDR阈值。Foxo3、Nr3c1和Ppargc1a亦显示范式依赖性效应量。结果支持反复糖皮质激素响应性转录的同时保留应激源特异性下游模式。
3.4 功能富集展示代谢重编程与OXPHOS异质性：Hallmark氧化磷酸化基因集在束缚和足底电击应激后显示正向归一化富集分数（NES），在社会挫败后为负向。外源物代谢和凝血在各范式一致正向富集，胆固醇稳态和mTORC1信号主要负向。脂肪酸代谢、凋亡和TNFα/NF-κB信号显示显著应激源依赖性方向性。这些结果描述相对转录模式，不确立小鼠肝脏线粒体呼吸、呼吸链复合体活性或ATP产生的相应变化。
3.5 皮质醇与HepG2细胞读数浓度依赖性变化相关：皮质醇暴露与CCK-8细胞脱氢酶活性浓度相关性降低及Annexin V/PI阳性细胞增加相关，RU486预处理和FOXO3靶向siRNA部分减弱这些变化。培养上清液ATP报告为归一化至匹配细胞蛋白的细胞外ATP，不作为细胞内ATP产生的直接测量。
3.6 GR拮抗和FOXO3靶向部分减弱皮质醇相关功能变化：1、5、10 μM皮质醇后CCK-8活性分别为91.6%±3.8%、72.4%±4.1%和53.7%±3.6%（对照100.0%±3.2%；总体ANOVA P<0.001），凋亡比例分别为9.7%±1.1%、20.6%±1.9%和35.4%±2.5%（对照4.8%±0.9%）。细胞外ATP从对照18.9±1.2 nmol/mg蛋白降至16.3±0.9、11.4±0.8和7.6±0.7 nmol/mg蛋白。与10 μM皮质醇相比，RU486组和siFOXO3组CCK-8信号分别增加29.1个百分点（95% CI 23.5-34.7）和26.8个百分点（20.8-32.8），凋亡比例分别降低20.6个百分点（?23.8至?17.4）和19.8个百分点（?23.0至?16.6），细胞外ATP分别增加6.9 nmol/mg（5.6-8.2）和6.4 nmol/mg（5.2-7.6），Tukey校正比较P<0.001。这些干预相关差异支持GR和FOXO3相关信号参与，但不确立干预特异性或通路顺序。
3.7 通路蛋白丰度与总FOXO3荧光提供互补细胞层面：免疫印迹显示10 μM皮质醇与较高GR丰度（对照的1.47±0.10倍）和较低磷酸化FOXO3/总FOXO3比值（0.31±0.03）相关，RU486预处理组分别为0.92±0.07和0.86±0.06。皮质醇还将PPARγ、PGC-1α、TFAM和COX IV丰度降至对照的0.37±0.04、0.34±0.04、0.39±0.04和0.42±0.04，两个干预组显示部分减弱，约为对照的0.74-0.82。siFOXO3组总FOXO3较低，但缺乏匹配的非靶向siRNA对照阻止该测量确立敲低特异性。免疫荧光报告为总FOXO3荧光而非核转位，因未计算核质比。蛋白和荧光测量与GR/FOXO3/PPARγ相关调控参与皮质醇响应一致，但未证明线性因果序列。
**讨论与结论总结**：本研究整合三个层面的证据并分别解释后综合考虑。第一，小鼠肝脏转录组显示束缚、社会挫败和足底电击应激中反复出现Fkbp5诱导。第二，同一肝脏数据显示Pparg表达、OXPHOS富集、脂肪酸代谢、炎症信号及其他代谢通路存在显著应激源依赖性。第三，在HepG2细胞中，药理学皮质醇暴露与脱氢酶活性、凋亡、细胞外ATP及选定GR/FOXO3/PPARγ相关蛋白变化相关，RU486预处理或FOXO3靶向siRNA后部分减弱。这种分层解释避免将细胞实验视为单一保守小鼠肝脏机制的直接验证。Fkbp5反复升高与肝脏糖皮质激素响应性转录信号一致；Pparg仅在束缚应激后显著降低，社会挫败应激可通过糖皮质激素信号之外的输入改变肝脏葡萄糖和脂质代谢。OXPHOS显示最明显的通路水平异质性。HepG2发现提供受控的细胞测试但需谨慎生物学解释：CCK-8反映细胞脱氢酶活性，所测ATP存在于培养上清液，细胞外ATP可随释放、膜完整性、细胞数目和细胞外核苷酸代谢变化，因此较低上清液浓度不能等同于线粒体ATP产生减少。RU486和FOXO3靶向siRNA部分减弱若干皮质醇相关功能和蛋白变化，但相似幅度的减弱不确立GR作用于FOXO3上游或二者位于单一主导通路。HepG2细胞与原发性人肝细胞在肝脏基因表达和代谢能力上存在显著差异，限制从该肝癌模型向外推至完整肝脏生理。结局指标不完全回归至载体对照值可由多种解释兼容，包括不完全受体拮抗、部分FOXO3靶向、脱靶效应、检测变异和并行皮质醇响应通路。局限性包括：转录组分析使用预设的19份非肿瘤批量肝脏样本子集；三项应激对比共享相同四份对照，排除基于独立性的组合显著性检验；计数过滤阈值预设但未正式评估替代阈值稳健性；HepG2细胞不能复现原代肝细胞代谢编程或多细胞和神经内分泌环境；10 μM皮质醇条件为药理学浓度；缺少RU486单独和non-targeting siRNA对照；总FOXO3荧光未分离核质 compartment；CCK-8测量脱氢酶活性，细胞外ATP受细胞能量产生之外过程影响，直接线粒体功能测量不可用。这些局限性约束因果和生理学解释，但不改变反复小鼠肝脏转录、应激源依赖性通路响应与HepG2模型中干预相关减弱之间的区分。
**研究结论翻译**：在三种慢性应激范式中，小鼠肝脏转录组显示反复出现及应激源依赖的重塑。Fkbp5在全部三项对比中升高，而Pparg和氧化磷酸化转录因应激源而异；外源物代谢和凝血显示更一致的正向富集，若干脂质、炎症和信号通路在各范式间变化。在HepG2细胞中，药理学皮质醇暴露与细胞脱氢酶活性、凋亡、细胞外ATP及GR/FOXO3/PPARγ相关蛋白的浓度相关变化相关。RU486预处理和FOXO3靶向siRNA部分减弱其中若干变化，支持这些调控组分参与，但不确立干预特异性或线性因果序列。联合发现因此定义一个分层应激响应框架，其中反复糖皮质激素响应性转录与下游肝脏代谢程序中显著的情境依赖性共存。
