工程化Lachnospiraceae模块化工具包实现小鼠肠道可编程IL-22递送并缓解MASLD

《Nature Microbiology》：Engineering commensal Lachnospiraceae for programmable therapeutic delivery in the mouse gut

工程化原生肠道细菌有望在肠道内实现持久、可编程的治疗性递送，但许多优势菌群仍难以进行遗传操作。专性厌氧Clostridia（梭菌纲）中的Lachnospiraceae（毛螺菌科）成员在人类肠道微生物组中广泛存在，并产生与肠道及代谢健康相关的代谢物。研究人员报道了一套用于工程化Lachnospiraceae的模块化工具包，包括组成型与诱导型表达、染色体整合及分泌系统。研究人员将该工具包应用于肠道原生Coprococcus comes，在小鼠肠道内编程分泌细胞因子白细胞介素-22（interleukin-22，IL-22），其可诱导上皮防御转录程序。在代谢功能障碍相关脂肪性肝病（metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease，MASLD）小鼠模型中，分泌IL-22的C. comes改善了葡萄糖稳态、降低了全身性内毒素血症并减轻了肝脂肪变性。该工作表明，原生Lachnospiraceae可被遗传编程以调节宿主代谢和免疫生理。该工具包为开发源自Lachnospiraceae的工程化治疗产品以及解析共生菌基因程序与宿主生理之间的因果关系提供了基础。

研究背景与问题：微生物组靶向治疗旨在编辑微生物群落的功能格局以惠及宿主。补充由微生物分离株或菌群原生编码的有益功能，已在感染性疾病、代谢综合征和银屑病等人体试验中显示潜力。通过遗传工程，治疗性微生物可被进一步编程以携带非原生代谢功能、异源蛋白分泌或可控定植，从而改变其在肠道中的行为。工程化活体生物治疗产品（engineered live biotherapeutic products，eLBPs）已在动物和早期人体试验中显示对代谢疾病、结肠炎和癌症的治疗潜力，但临床疗效常不及预期。现有eLBPs多依赖模式微生物，不能代表肠道菌群多样性，且治疗活性多发生于肠道转运期。利用更广泛的肠道微生物作为底盘，可能克服定植持久性限制并提供更多有益微生物代谢物。Lachnospiraceae（毛螺菌科）是人类肠道中丰富的专性厌氧Clostridia，参与短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFA）产生、次级胆汁酸转化和定植抵抗，且在炎症和代谢疾病中常较健康对照减少；但该科遗传工具缺乏。为此，研究人员开发模块化工具包，并以肠道原生Coprococcus comes为底盘递送IL-22（interleukin-22，白细胞介素-22），在MASLD（metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease，代谢功能障碍相关脂肪性肝病）小鼠模型中验证治疗潜力。该论文发表于《Nature Microbiology》。重要意义在于将原生Lachnospiraceae拓展为可编程肠道递送底盘，并为解析共生菌基因程序与宿主生理因果关系提供基础。

关键技术方法：研究人员优化Escherichia coli与Lachnospiraceae的厌氧接合转移，以pMTL穿梭载体递送遗传货物；用NanoLuc/FAST报告系统评价启动子；构建TetR–P_tet等诱导系统；用LtrA group II intron–lox66/67–Cre-lox实现染色体整合；对C. comes、A. caccae和M. gnavus进行体外及15成员悉生小鼠体内RNA-seq，结合promoter-ID构建启动子–RBS（ribosome-binding site，核糖体结合位点）文库；对M. gnavus培养上清进行蛋白质组学并用SignalP预测信号肽，构建分泌信号文库；在SPF、无菌/悉生及西方饮食+30%果糖MASLD小鼠中评估，SPF C57BL/6J购自The Jackson Laboratory，无菌/悉生小鼠由University of Chicago Gnotobiotic Research Animal Facility繁育，另用人临床分离A. caccae LAHUC31验证启动子。

研究结果：
Programming gene expression in Lachnospiraceae（在Lachnospiraceae中编程基因表达）：通过优化E. coli与目标Lachnospiraceae的接合转移，研究人员构建了来自高表达持家基因EF-Tu和σ70的组成型启动子，并在多种Lachnospiraceae中检测NanoLuc表达；启动子强度随宿主背景变化，PAhS70亦支持FAST报告。工程菌灌胃SPF小鼠后6 h粪便可检测发光，提示异源基因表达可在哺乳动物肠道维持。TetR–P_tet系统呈现aTc剂量依赖诱导，输出动态范围从L. symbiosum的8倍至C. comes的164倍；木糖诱导响应较慢。利用group II intron–Cre-lox在C. comes和M. gnavus染色体插入货物，整合菌在无抗生素传代时稳定性增加，报告表达与质粒相当或更高；但无选择传代后NanoLuc发光约下降10倍，未见序列突变，thiamphenicol可恢复表达。结论是建立了组成型/诱导型表达和染色体整合工具。

Transcriptomics-informed expansion of the Lachnospiraceae expression toolkit（转录组指导扩展Lachnospiraceae表达工具包）：通过对C. comes、A. caccae和M. gnavus体外单培养与15成员悉生小鼠体内条件进行RNA-seq，研究人员发现Lachnospiraceae适应肠道定植涉及碳源/氨基酸利用、脂肪酸生物合成及细菌竞争等变化。以C. comes为模型，结合promoter-ID和差异表达分析筛选25个启动子–RBS候选，体外表达动态范围约10⁶；6个代表启动子在M. gnavus中可转移且表达排序一致。小鼠中评估P3185（体外偏向）、P15915（体内偏向）和P4280（双条件）后，P4280-NanoLuc工程C. comes粪便发光最高，P15915体内强诱导，P3185几乎检测不到；P4280经截短和RBS改造进一步模块化。结论是获得条件感知的天然启动子组，并强调环境背景对启动子性能的影响。

Developing secretion systems for Lachnospiraceae（开发Lachnospiraceae分泌系统）：通过比较M. gnavus培养上清与细胞裂解物的蛋白质组学、SignalP预测及共识信号肽合成，研究人员构建NanoLuc融合信号肽库并导入C. comes。多数信号序列增加胞外NanoLuc；REA14使>99%总NanoLuc定位上清，RgSS01产生约100–200 ng ml^?1 NanoLuc，而无信号对照约1 ng ml^?1，故选用RgSS01。利用IbpA截短变体IbpA379-607和胰蛋白酶敏感性实验，研究人员还确定可在C. comes表面展示NanoLuc。结论是建立了可用于Lachnospiraceae蛋白输出或展示的分泌信号与表面展示元件。

C. comes-produced mIL-22 alters host gene expression and microbiota composition（C. comes产生的mIL-22改变宿主基因表达和菌群组成）：研究人员将RgSS01–小鼠IL-22（mouse IL-22，mIL-22）融合蛋白导入C. comes，在组成型、aTc诱导型及基因组整合格式下均检测到分泌，峰值约100 ng ml^?1，无RgSS01时仅约1 ng ml^?1；HT-29-MTX细胞STAT3磷酸化实验显示其生物活性与商品化重组mIL-22相当。随后构建染色体整合双顺反子菌株Cc-IL-22，共表达RgSS01-mIL-22和NanoLuc。SPF小鼠每周三次灌胃3周后，剂量接种物中游离IL-22低于ELISA检测限，肠道内容物和血清未检出IL-22升高，但回肠Reg3b、Reg3g诱导，结肠较弱；回肠RNA-seq显示Reg3、氧化应激/抗菌程序（Duox2、Nox1、Nos2）及免疫激活标志（Ighv1-34、Igkv17-121、Saa1）上调。16S rRNA（16S ribosomal RNA，16S核糖体RNA）纵向分析显示第21天Cc-IL-22组与野生型C. comes组群落组成分离（PERMANOVA，置换多元方差分析；R²=0.344，P=0.038），MaAsLin2和LEfSe识别候选 taxa，但ALDEx2多重校正后未见稳健属/科水平变化。结论是原生Lachnospiraceae底盘递送的IL-22在体内有生物活性，激活上皮防御通路并伴随可测的菌群结构变化。

IL-22-secreting C. comes attenuates diet-induced liver injury（分泌IL-22的C. comes减轻饮食诱导肝损伤）：研究人员用西方饮食加30%果糖水8周建立MASLD小鼠模型，随后8–11周给予培养基、野生型C. comes或Cc-IL-22。Cc-IL-22组体重增长减轻、空腹血糖降低、腹腔葡萄糖耐量试验（glucose tolerance test，GTT）葡萄糖清除改善，但胰岛素敏感性未改善；菌群组成和盲肠代谢物谱在Cc与Cc-IL-22组间大体相似。肝组织学显示Cc-IL-22组平均脂滴尺寸降低、大脂滴减少，血清天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）降低，肝重、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）和肝甘油三酯呈降低趋势；血清脂多糖结合蛋白（lipopolysaccharide-binding protein，LBP）降低，肝Tnf和Ccl2表达降低，Il1b和Adgre1不变。结论是肠道局部递送IL-22改善代谢健康并减轻肝损伤，支持减少系统性微生物产物暴露和肝脏炎症水平的模型。

讨论部分总结：Lachnospiraceae作为丰度高的肠道定植菌，具有菌株特异性代谢和免疫调节功能，是eLBPs有吸引力的底盘。研究人员建立的工具包支持多种Lachnospiraceae的组成型和诱导型表达，启动子及整合系统可跨宿主转移；源自C. comes转录组的天然启动子–RBS元件具有宽动态范围和条件偏向，虽启动子活性会随菌群组成、饮食、宿主生理和抗生素暴露变化，但所选启动子在 distinct in vivo contexts 中保留肠道活性。工具包还实现诱导型控制，并通过group II intron–Cre-lox在C. comes和M. gnavus中稳定整合转基因；未来可引入CRISPR-associated transposase（CAST）系统或bridge recombinases以拓展整合策略。分泌信号文库支持重组蛋白肠道递送；Cc-IL-22概念验证显示其诱导回肠上皮防御程序，并在MASLD模型中减轻治疗期体重增长、代谢功能障碍和肝脂肪变性，降低血清LBP及肝Tnf、Ccl2，支持局部IL-22主要作用于肠道界面、减少系统性微生物产物暴露从而减轻肝脏炎症和脂肪变性的模型。未来需纳入摄食量、体成分、间接测热、粪便能量损失、屏障功能和组织特异性IL-22信号读出以界定机制和治疗范围。转化挑战包括生长苛养、氧敏感和可控定植；定向进化、互养互作、转化/接合效率提升及配对益生元或正交代谢生态位可能改善定植。研究中原生菌仅短暂肠道停留仍取得疗效，提示持久定植并非所有活体生物治疗应用所必需。

研究结论翻译：总之，这些结果将原生Lachnospiraceae呈现为一个遗传可操作的肠道共生菌家族，可被用于在肠道生态系统内实现可编程治疗性递送。