SF3B1突变通过circATP9B招募SFPQ并滞留NPM1于细胞质抑制p53依赖性凋亡

《Journal of Molecular Biology》：Cancer-associated SF3B1 mutation inhibits apoptosis via circATP9B

癌症相关的SF3B1突变通过circATP9B抑制凋亡。SF3B1突变通过招募SFPQ在多种细胞系中促进circATP9B的产生。CircATP9B通过与NPM1相互作用抑制p53依赖性凋亡。circATP9B过表达导致NPM1滞留于细胞质。CircATP9B敲低促进SF3B1突变细胞中的p53依赖性凋亡。CircATP9B敲低可逆转SF3B1突变引起的NPM1细胞质滞留。

研究背景方面，SF3B1是多种癌症中最常见的突变剪接因子之一，见于骨髓增生异常综合征（MDS）、慢性淋巴细胞白血病、葡萄膜黑色素瘤（UVM）等，在乳腺癌和胰腺癌等实体瘤中突变频率为1%至3%。SF3B1是U2小核核糖核蛋白（U2 snRNP）的必要组分，参与分支点序列的识别与结合，其突变主要导致3‘剪接位点异常RNA剪接，干扰众多前体mRNA（pre-mRNA）的剪接。已有研究显示SF3B1突变导致促凋亡BH3-only BCL2家族基因（如BAD、BIK、BMF和BBC3）表达下降，携带SF3B1突变的细胞对喜树碱诱导的凋亡表现出更强耐受性，但分子机制尚未完全阐明。环状RNA（circRNA）是一类共价闭合环状结构的非编码转录本，其生物发生依赖经典RNA剪接机制，RNA结合蛋白如SFPQ、QKI也通过拉近远端内含子促进反向剪接参与circRNA形成。研究人员前期研究证明SF3B1突变干扰circRNA产生包括circATP9B，但潜在机制不明。因此研究人员探究SF3B1突变是否通过招募驱动反向剪接的RNA结合蛋白促进circRNA生物发生。circRNA通过海绵吸附微小RNA、调控基因表达、被翻译、与蛋白质互作等多种机制促进癌症进展。前期研究证明circATP9B与MYH9互作调节DNA损伤应答中的核肌动蛋白丝形成。本研究发现circATP9B还与据报道通过p53调控凋亡的NPM1互作，据此探究circATP9B是否也参与凋亡调控。研究人员得出结论：SF3B1-K700E突变通过招募SFPQ增强circATP9B产生，SFPQ结合于circATP9B侧翼内含子；circATP9B与NPM1互作导致NPM1滞留于细胞质，从而抑制p53依赖性凋亡。该研究揭示了SF3B1突变驱动肿瘤发生的新机制，即通过circATP9B介导的NPM1细胞质滞留抑制p53依赖性凋亡，拓展了对SF3B1突变致癌机制的理解。

技术方法方面，研究人员采用CRISPR-Cas9技术构建SF3B1-K700E杂合突变及同义突变（K700K）的K562细胞系（由Ubigene Biosciences构建），使用K562、Hela和HEK293T细胞系；开展circRNA测序（circRNA-seq）并进行数据分析（数据存入GEO数据库GSE335551）；采用RNase R处理鉴定circRNA稳定性；通过亚细胞分级分离和RNA荧光原位杂交（FISH）分析亚细胞定位；利用RNA pulldown结合质谱（LC-MS/MS）鉴定circRNA结合蛋白；采用RNA免疫沉淀（RIP）、免疫沉淀（IP）、Western blot和免疫荧光（含TUNEL assay）检测分子互作与凋亡；通过catRAPID算法预测RNA-蛋白质互作，RNAfold预测二级结构，RNAComposer生成三维结构，HDOCK进行分子对接；使用GraphPad Prism进行统计分析。

研究结果方面，第一，SF3B1-K700E突变促进K562细胞中circATP9B表达。研究人员通过CRISPR-Cas9构建SF3B1-K700E及K700K K562细胞，circRNA测序发现SF3B1-K700E突变增加circATP9B丰度，与前期在HEK293T和Hela细胞中的发现一致；表征证实circATP9B由ATP9B pre-mRNA外显子5至外显子10反向剪接形成，在RNase R处理下保持稳定；亚细胞分级分离和FISH显示circATP9B主要定位于细胞质。

第二，SF3B1-K700E突变通过招募SFPQ促进circATP9B产生。研究人员分析前期质谱数据中与突变SF3B1互作改变的蛋白，并结合RBPmap和RBPsuit数据库鉴定RNA结合蛋白，在8个候选蛋白中选取已报道调控circRNA生成的SFPQ进一步验证；免疫共沉淀证实SF3B1-K700E突变增强SF3B1与SFPQ结合；发现SFPQ经典识别序列（UGUAAU）富集于circATP9B侧翼内含子；RIP显示SFPQ对ATP9B pre-mRNA内含子4和内含子10结合更强；缺失SFPQ结合序列的circATP9B构建体（尤其上下游同时缺失）显著降低circATP9B产生；SFPQ敲低显著降低SF3B1-K700E突变细胞中circATP9B表达水平。此外，分析SFPQ eCLIP峰发现SF3B1突变失调circRNA的反向剪接位点侧翼内含子SFPQ富集显著高于未受影响者，且这些内含子含更高比例的隐蔽3’剪接位点。

第三，circATP9B与NPM1互作。研究人员分析前期circATP9B沉淀蛋白的质谱数据发现circATP9B结合NPM1；RNA pulldown显示circATP9B探针在三种细胞中有效捕获NPM1蛋白；NPM1抗体RIP成功拉下circATP9B；免疫荧光显示二者共定位于细胞质；HDOCK三维对接模型预测二者稳定互作。

第四，circATP9B过表达通过滞留NPM1于细胞质抑制凋亡。研究人员合成circATP9B表达构建体，发现circATP9B过表达抑制p14Arf、p53和p21表达，并显著减弱喜树碱引起的这些蛋白上调；喜树碱处理后circATP9B过表达降低BIK、BAD、BMF、BBC3表达；改变凋亡标志蛋白caspase-3、BCL2、BAX水平并显著减少TUNEL阳性细胞数。circATP9B过表达不影响NPM1 mRNA和蛋白表达；过表达导致细胞质NPM1蛋白分布增加，而核输出抑制剂leptomycin处理后该现象被逆转，且leptomycin显著促进过表达circATP9B细胞的凋亡。结果表明circATP9B通过滞留NPM1于细胞质抑制p53依赖性凋亡。

第五，敲低circATP9B促进SF3B1-K700E突变细胞凋亡。SF3B1-K700E突变显著抑制喜树碱诱导的p53依赖性凋亡，表现为p14ARF、p53、p21表达下降、促凋亡基因下调、凋亡相关蛋白异常表达及TUNEL阳性细胞显著减少；敲低circATP9B可逆转SF3B1突变细胞的抗凋亡表型。敲低circATP9B不影响NPM1总表达，喜树碱处理不影响circATP9B或NPM1表达；SF3B1-K700E突变与NPM1细胞质定位增加相关，而敲低circATP9B降低突变细胞中细胞质NPM1蛋白水平。

讨论部分总结：研究人员前期发现SF3B1突变干扰circRNA产生导致circATP9B表达升高，本研究探究其分子机制，发现SF3B1-K700E突变通过招募结合于circATP9B侧翼内含子的RNA结合蛋白SFPQ增强circATP9B产生；circATP9B与NPM1互作导致NPM1滞留于细胞质，从而抑制p53依赖性凋亡。NPM1为核磷蛋白，持续穿梭于核质之间，参与核糖体生物发生、DNA修复和中心体复制等过程；NPM1突变是急性髓系白血病（AML）最常见遗传异常之一，约占新发AML的30%，导致NPM1细胞质定位，为AML公认诊断标志。NPM1突变在MDS中罕见（约1-6%），NPM1突变MDS患者有快速转化为AML的高风险。SF3B1是MDS中最常见的剪接因子突变（约20-30%），SF3B1突变MDS通常归类为低危MDS，预后较好、转化为AML风险低（约7%）。SF3B1与NPM1突变在MDS和AML中共现罕见，NPM1突变AML中SF3B1作为MDS相关共突变发生率仅2-5%，低共现率提示二者在髓系肿瘤中可能有冗余效应。NPM1突变通过改变NPM1核定位信号改变其核质分布，而本研究表明SF3B1突变通过circATP9B介导的NPM1细胞质隔离和降解改变其核质分布，揭示了调控NPM1功能的新分子机制。SF3B1突变影响多种生物学功能并驱动癌症进展，携带SF3B1突变的细胞促凋亡BH3-only BCL2家族基因mRNA水平降低，对凋亡刺激如拓扑异构酶抑制剂喜树碱更具耐受性，但分子机制尚不完全清楚；本研究证明SF3B1突变促进circATP9B产生，circATP9B与NPM1互作导致后者滞留于细胞质从而抑制p53依赖性凋亡，拓展了对SF3B1突变致癌机制的理解。SF3B1是U2 snRNP关键组分，SF3B1-K700E突变改变SF3B1与SUGP1、GPATCH8等调控蛋白的结合动态，导致U2 snRNP选择替代分支点序列；同样本研究发现SF3B1-K700E突变增强SF3B1与SFPQ结合导致circATP9B反向剪接增加。在范可尼贫血（FA）相关AML克隆演化分析中SFPQ被鉴定为突变基因之一，提示SFPQ突变可能参与从遗传性骨髓衰竭向髓系恶性肿瘤的转化；SFPQ在神经和骨骼肌系统条件性敲除分别导致神经元和肌肉细胞凋亡增加，但目前尚无SFPQ在血液系统作用的研究报道，未来探究造血系统SFPQ缺失是否导致MDS特征性髓系疾病将有意义，分析患者数据集探究MDS病程中SFPQ表达是否改变及其是否与circATP9B等circRNA表达改变相关也值得关注。研究结论翻译：SF3B1-K700E突变通过招募SFPQ促进circATP9B产生；circATP9B与NPM1互作导致NPM1滞留于细胞质，在喜树碱诱导的凋亡应激下，滞留于细胞质的NPM1破坏p14Arf稳定性，从而抑制p53激活，抑制细胞凋亡。