人源相关剂量聚苯乙烯纳米塑料暴露损伤小鼠及人源结肠类器官上皮细胞谱系

《Journal of Hazardous Materials Advances》：Exposure to nanoplastics at a human-relevant dose impairs epithelial cell lineage in murine and human colonoid models

研究人员采用无添加剂、表面功能化的聚苯乙烯纳米塑料（polystyrene nanoplastics, nPS）于人源相关剂量下进行暴露实验。在小鼠结肠类器官（colonoids）中，共鉴定出274个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）。研究分析了小鼠对照组及人源疾病结肠类器官（包括结直肠癌[colorectal cancer, CRC]与克罗恩病[Crohn's disease]）。结果显示，LGR5（leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5）表达下调与EPCAM（epithelial cell adhesion molecule）表达上调为所有类器官模型的共同特征。在一项先导研究中，nPS在对照与克罗恩病患者来源的类器官中诱发了方向相反的炎症反应。

塑料在日常生活中应用广泛，已造成微塑料（microplastics，直径小于5 mm）和纳米塑料（nanoplastics，直径小于1 μm，统称MNPs）对环境的污染。食品链污染及在人体组织中的检出引发了公众对人类暴露健康影响的担忧。既往研究多聚焦于商品化原始聚苯乙烯（PS）颗粒，在小鼠中已证实口服PS MNPs可破坏肠道稳态，诱导从十二指肠到结肠的活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成与细胞凋亡，并引起结肠炎症、氧化应激、黏液分泌减少及屏障功能受损。体外研究则主要依赖肠道上皮细胞系，结果不一：Caco-2细胞经8周慢性暴露未见DNA或氧化损伤，但短期暴露可产生细胞毒性与ROS升高；共培养与三培养模型虽显示nPS可被高效摄取并跨屏障转位，却未检出明显的遗传毒性。这些传统细胞系难以重现肠道上皮屏障的整合机制。此外，商用模型常含未披露的工艺添加剂与表面活性剂，且环境风化导致的表面氧化（如羧基生成）未被充分考虑；同时由于MNPs在粪便中蓄积量高于小肠内容物，亟需聚焦结肠的研究。因此，研究人员旨在利用肠道类器官（intestinal organoids）——一种干细胞来源的、能维持源组织功能及分子细胞异质性的三维结构——以无添加剂、经表面羧基化模拟环境老化的nPS，在10 μg mL^-1这一基于人血微塑料检测数据推算的生理学相关剂量下，系统评估其对结肠上皮细胞谱系的影响，并探究小鼠与人源应答的可转化性，以及不同疾病背景（结直肠癌、克罗恩病）下的反应差异。

关键技术与方法方面，研究人员采用无皂乳液共聚法合成羧基化聚苯乙烯纳米塑料（nPS），利用动态光散射（DLS）、原子力显微镜（AFM）及镍离子（Ni²⁺）络合竞争法测定其水动力直径、表面形貌与羧基密度。类器官样本来源于7周龄雄性C57BL/6小鼠及接受结直肠癌（n=3）、克罗恩病（n=3）、对照患者（n=3）的手术废弃结肠组织。隐窝嵌入Matrigel培养成三维类器官，或进一步消化接种为二维单层，以10 μg mL^-1 nPS暴露1至4天。通过乳酸脱氢酶（LDH）法检测细胞毒性，采用RNA测序与RT-qPCR分析差异表达基因（DEGs），利用免疫荧光染色检测EPCAM与PCNA，借助QuPath软件提取形态参数，并使用Luminex多因子检测定量炎症介质水平。

3.1 nPS的合成与表征
研究人员通过无皂乳液共聚成功合成平均粒径为370 nm、多分散指数（polydispersity index, PDI）为0.08、表面呈覆盆子状且羧基（COOH）密度达826 μmol g^-1的羧基化nPS，其理化特性可较好地模拟环境中部分老化的聚苯乙烯颗粒。

3.2 nPS在小鼠结肠类器官中的转录组应答
小鼠结肠类器官经10 μg mL^-1 nPS暴露2天后，无细胞死亡。转录组分析共鉴定出274个上调与100个下调的差异表达基因（DEGs）。最显著上调的金属离子转运蛋白基因为Slc11a2（log₂ fold change = 2.8），最显著下调的干细胞标志物为Lgr5（log₂ fold change = -2.5）。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析显示，DEGs显著富集于AGE-RAGE信号通路；基因本体论（Gene Ontology, GO）分析则提示最显著的生物学过程（biological process, BP）为胶原生物合成与代谢，细胞组分（cellular component, CC）为细胞外基质，分子功能（molecular function, MF）为跨膜信号受体活性，且这些通路均与上皮分化密切相关。

3.3 nPS对小鼠结肠类器官上皮分化与增殖的影响
RT-qPCR验证证实nPS降低了Lgr5与Ephb2表达，同时升高了Epcam、Vil1与Krt20的mRNA水平，并在蛋白水平确认了EPCAM增加。形态计量学分析显示，类器官数量未变，但面积在暴露第1、3、4天显著缩小，圆形度自第3天起降低，提示出芽分化增强。然而，PCNA免疫荧光显示细胞增殖未受影响，表明nPS在无明显细胞死亡的情况下迫使小鼠肠上皮走向终末分化。

3.4 nPS对人Caco-2细胞系上皮分化与增殖的影响
在Caco-2人结直肠腺癌细胞系中，同等剂量nPS暴露未引起LGR5、EPHB2、EPCAM及VIL1的显著改变，SLC11A2亦无变化。划痕实验仅显示前2天的一过性增殖增加；EPCAM免疫荧光在10或100 μg mL^-1 nPS处理后反而降低。结果表明Caco-2细胞无法复现类器官中观察到的nPS诱导上皮分化紊乱。

3.5 nPS对对照患者来源人结肠类器官上皮分化与增殖的影响
人源对照患者结肠类器官中，nPS暴露同样导致LGR5在所有3例供体中显著下调，EPHB2呈降低趋势，EPCAM与VIL1均显著上调，且该效应在基底外侧与肠腔侧暴露中均存在。EPCAM蛋白水平升高得到免疫荧光确认，但类器官出芽减少、圆形度增加，PCNA染色显示4天暴露后增殖受到抑制。

3.6 nPS对结直肠癌患者来源人结肠类器官上皮分化与增殖的影响
结直肠癌（CRC）患者来源类器官表现出与对照类器官相似的变化：LGR5与EPHB2在多数患者中下调，EPCAM与VIL1一致上调，经肠腔侧暴露可重现该效应。三维培养中类器官出芽减少、圆形度增加，PCNA阳性细胞比例下降，提示nPS同样干扰了肿瘤来源类器官的上皮谱系与增殖平衡。

3.7 nPS对炎症模型中上皮分化与增殖的影响
在脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的炎症模型中，nPS单独处理即可下调小鼠类器官Cxcl1及人源对照类器官IL8/TNF表达，并与LPS协同进一步抑制这些炎症因子转录，同时下调Lgr5。但在克罗恩病来源类器官中，nPS未降低TNF或IL8，反而在LPS刺激下呈现促炎趋势；值得注意的是，nPS在该类器官中仍一致下调LGR5并上调EPCAM，表明疾病状态改变了炎症应答，但上皮谱系标志物的紊乱仍保守存在。

3.8 nPS对对照与克罗恩病类器官炎症介质分泌的影响
先导研究首先排除了nPS对LPS及细胞因子吸附所造成的实验偏倚。在人源对照类器官中，基础状态下nPS增加IL6、TNF、IFNG等多种介质分泌，呈促炎效应；但在LPS刺激下，nPS共暴露反而降低多数炎症因子释放，呈抗炎效应。相反，在克罗恩病类器官中，基础暴露减少CCL5、CXCL2等分泌，而LPS刺激后nPS共暴露却增强TNF、IL17A等促炎介质的分泌。该结果提示nPS对炎症介质分泌的影响具有高度疾病情境依赖性。

讨论与结论部分指出，10 μg mL^-1的暴露剂量基于人体血液微塑料浓度检测数据，具有生理学相关性，且当前分析技术可能低估了更小颗粒的真实污染水平。研究利用无添加剂、表面氧化的nPS，更接近真实环境颗粒。转录组数据提示Slc11a2上调可能是铁死亡（ferroptosis）激活的早期信号，但在该实验条件下不足以诱导细胞死亡。研究最显著的发现是EPCAM在所有测试类器官类型中蛋白与mRNA水平的一致升高，结合LGR5下调，首次揭示了纳米塑料对肠上皮细胞身份的保守性扰乱。然而，其功能性后果因物种与病理微环境而异：小鼠表现为终末分化加速，人源对照与癌症类器官分化减慢，克罗恩病类器官则呈现时间依赖性的分化模式转变；增殖效应亦不一致（小鼠不变、人源对照与CRC降低、克罗恩病类器官升高）。炎症方面，nPS在健康上皮中基础促炎、LPS刺激后抗炎，但在克罗恩病类器官中却可能加剧炎症，这与该疾病中免疫细胞的耗竭 profile 类似，提示纳米塑料对克罗恩病的结肠炎症恶化具有潜在贡献。研究存在样本量小、LGR5功能验证缺失、缺乏长期效应评估等局限，且纳米塑料的聚合物类型、形状、尺寸等复杂性尚未完全涵盖。

研究结论：本研究表明，在环境老化、人源相关剂量的聚苯乙烯纳米塑料暴露下，小鼠及人源结肠类器官中的上皮细胞谱系标志物发生保守性紊乱，表现为LGR5下调与EPCAM上调。炎症应答则呈现高度情境依赖性：纳米塑料在对照类器官中发挥促炎或抗炎作用取决于LPS刺激状态，而在克罗恩病类器官中却诱发方向相反的炎症反应。常用Caco-2细胞系无法模拟上述应答，凸显了类器官模型在纳米毒性评估中的必要性。尽管受限于样本量与长期数据缺失，本研究证实纳米塑料可破坏肠道上皮稳态，并强调采用生理相关剂量与先进模型研究其健康影响的重要性。