《Nature Structural & Molecular Biology》：Large-scale RNA-binding protein tethering screen discovers modulators of circular RNA metabolism
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环形RNA（circRNA）是哺乳动物细胞中新兴的重要调控分子，也是具前景的RNA治疗载体，但其代谢所依赖的反式作用因子仍定义不清。研究人员通过拴系报告系统（tethered reporter assay）系统评估730种RNA结合蛋白（RBP），鉴定出281
环形RNA（circRNA）是哺乳动物细胞中新兴的重要调控分子，也是具前景的RNA治疗载体，但其代谢所依赖的反式作用因子仍定义不清。研究人员通过拴系报告系统（tethered reporter assay）系统评估730种RNA结合蛋白（RBP），鉴定出281种可显著调控circRNA活性的RBP。后续实验将这类RBP定位至circRNA生命周期的关键阶段，包括生物发生、核输出、降解与翻译。研究人员进一步识别出7种可增强治疗级circRNA载体翻译的RBP，并强调LARP4B作为跨多种内部核糖体进入位点（IRES）与细胞类型的强效外源circRNA翻译增强因子。此外，研究人员发现RBM15在果蝇、小鼠与人中演化保守地调控circRNA生物发生，同时参与核滞留；利用dCasRx或反义寡核苷酸（ASO）扰动RBM15结合位点即可调制内源circRNA表达。该研究提供了circRNA反式调控的全景视图，并为治疗开发提供了实用切入点。
研究背景与立项依据
环形RNA（circRNA，共价闭合RNA分子）由前体mRNA经反向剪接（backsplicing，下游5′剪接位点与上游3′剪接位点连接成环）产生，具有稳定性高、免疫原性低的特征，可作为microRNA海绵、蛋白支架及翻译模板，并正被开发为疫苗与治疗性载体。然而，相较于线性mRNA，circRNA翻译效率偏低，且调控其生物发生、核输出、降解与翻译的反式作用因子（trans-acting factors）长期未被系统绘制；已知QKI、FUS、MBNL1、SFPQ等少数RNA结合蛋白（RBP）多结合内含子侧翼序列，难以解释外显子区与保守调控逻辑。该研究发表于《Nature Structural 》相关姊妹刊体系，旨在以规模化功能筛选补齐这一认知缺口。
主要技术方法概览
研究人员构建基于MS2线圈的circFirefly/circRenilla双荧光素酶报告系统，强制将MCP-RBP融合蛋白拴系至circRNA，阵列化筛选846个RBP异构体；以体外转录成环系统（exo-circRNA）区分生物发生与翻译效应；结合增强紫外交联免疫沉淀（eCLIP）、RIP-seq、核质分离qPCR、结构域截断、dCasRx阻断与反义寡核苷酸（ASO）干预，并在人源细胞（HeLa、HEK293T、HepG2、U2OS）、小鼠N2A细胞及果蝇神经元中验证保守性。
研究结果解读
建立环形RNA报告系统与全规模RBP拴系筛选
研究人员以最小ZKSCAN1内含子驱动成环，分裂荧光素酶仅在成功反向剪接后表达。筛选730个RBP（846异构体），以|log2FC|>0.5且FDR<0.05判定，获281个RBP（296异构体）为候选效应因子，其中267个正调、29个负调。聚类显示正调因子富集于剪接、转运、翻译起始，负调因子富集于降解与剪接抑制，证明系统可分辨生命周期各阶段调控者。
识别促进外源环形RNA翻译的RBP
在外源成环系统中，LARP4B跨EMCV、PV、CrPV多种IRES与多细胞系稳定增强翻译，不提高RNA丰度；ANXA2仅限HeLa。聚焦筛选增补NUFIP2、HSPB1、NOB1、BCDIN3D、PKM、GNB2L1等6个增强因子。机制上LARP4B结合eIF3A与eIF4G2，偏好AU富集3′UTR样序列；向载体嵌入poly(A)/poly(U)序列可内源招募类似因子，使蛋白产量提升4–8倍。
RBM15是内源环形RNA的多面调控因子
过表达/敲低测序显示RBM15正调逾700种内源circRNA，且不影响线性同源转录本。拴系实验表明RBM15同时促进成环与核滞留：核内circRNA可升约140倍，浆内仅微增。结构域作图显示Disordered2+SPOC促生物发生，RRM2/3参与核滞留。
RBM15直接结合前体mRNA并驱动反向剪接
RIP与位点删除实验证实RBM15结合反向剪接接头（BSJ）附近外显子区，删除结合位点削弱成环。利用dCasRx或ASO封堵结合位点，可选择性下调circSP3(1)、circZRANB1(1)，提供不依赖BSJ靶向的新型circRNA干扰策略。
RBM15通过IGF2BP1实现核滞留
亲和纯化质谱发现RBM15与IGF2BP1的互作依赖RNA存在；过表达RBM15将IGF2BP1扣留在核内，过表达IGF2BP1可部分 resc 核滞留表型，说明RBM15经隔离出核适配蛋白调控亚细胞定位。
跨物种保守性
RBM15结合位点富集于保守外显子区；小鼠N2A中正交过表达/敲低复现circRtn4调控；果蝇nito（RBM15同源）RNAi与过表达显示circRNA分数双向变化，证明该反式调控逻辑在人、鼠、果蝇间保守。
讨论与结论翻译
讨论指出，该研究将拴系功能筛选建立为解析circRNA反式调控的通用平台：一方面产出LARP4B等翻译增强模块，支持“共递RBP”或“RNA适配体招募内源RBP”两类治疗载体优化路径；另一方面揭示RBM15以外显子结合驱动生物发生、以IGF2BP1依赖方式介导核滞留的双功能模型，并给出靶向RBM15位点的ASO/dCasRx损耗策略。结论为：研究人员系统绘制了circRNA代谢的RBP调控网络，发现LARP4B广谱翻译增强与RBM15保守成环/滞留双功能机制，为环形RNA药物效率提升与内源circRNA精准干预提供了可转化入口。
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