《Journal of Agriculture and Food Research》：A Sensitive Electrochemical Aptasensor for Hazardous Paraquat Detection Using Impedimetric Analysis
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本研究开发了一种电化学适配体传感器用于检测百草枯（PQ）。新型N-苯基邻氨基苯甲酸聚合物修饰于丝网印刷碳电极（SPCE）上，实现了简化的单步适配体偶联。该PQ适配体传感器在纳克级检出限（LOD）下提供了宽检测范围。在2.9 Hz下进行阻抗测量可绕过全谱扫描，从
本研究开发了一种电化学适配体传感器用于检测百草枯（PQ）。新型N-苯基邻氨基苯甲酸聚合物修饰于丝网印刷碳电极（SPCE）上，实现了简化的单步适配体偶联。该PQ适配体传感器在纳克级检出限（LOD）下提供了宽检测范围。在2.9 Hz下进行阻抗测量可绕过全谱扫描，从而加快PQ检测速度，适用于现场研究。该适配体传感器在实际样品中的应用获得了81.20%至115.10%的回收率。
一、研究背景与问题提出
百草枯（1,1′-二甲基-4,4′-联吡啶二氯化物，PQ）是一种广泛使用的非选择性除草剂，自20世纪60年代问世以来因其速效和低成本而在全球大量施用。然而，PQ对人体具有高毒性，可致急性中毒甚至死亡，其作用机制主要围绕联吡啶结构引发的氧化还原循环，进而产生活性氧（ROS）、扰乱抗氧化系统并损伤暴露细胞。约10–20 mL的20% w/v PQ暴露即可导致极高的死亡率与发病率。虽经摄入是常见暴露途径，但皮肤接触与吸入污染环境同样可造成严重生命威胁。研究还发现PQ暴露与帕金森病（PD）和阿尔茨海默病（AD）风险升高相关。尽管已有70多个国家实施禁令和严格管控，其非法使用及在环境中超过5年的持久残留仍不容忽视，需要密切监测。多个组织已制定PQ残留限量，如泰国污染控制部门规定饮用水中PQ最大限量为0.5 mg L?1，美国环保署则设定更低的30 μg L?1。因此，灵敏的分析方法对复杂基质中PQ残留检测至关重要。色谱技术虽为主流，但存在成本高、耗时长、操作复杂及需专业人员等局限。在荧光光谱法、分光光度法、表面增强拉曼光谱（SERS）等替代方法中，电化学方法因便携、经济、易用而成为最有前景的替代方案。
电化学技术将识别元件与目标分析物的相互作用转换为可测量的电信号，兼具高灵敏度与选择性，并具有小型化、低成本、低样品量、快速分析等优势。其中，适配体集成的电化学技术即适配体传感器是极具竞争力的候选。适配体作为人工抗体的单链寡核苷酸，其化学合成可控且可放大，能最大限度减少批间差异、人力需求和成本。已有研究采用差分脉冲伏安法（DPV）监测PQ–适配体复合物形成，或利用PQ自身氧化还原特性作为信号产生中间体。然而，电化学阻抗谱（EIS）用于PQ分析的研究相对不足。EIS是一种强大且非破坏性的技术，通过施加交变电位并测量响应电流来测量电化学系统的阻抗，能够探测电荷转移电阻和界面性质，特别适合研究修饰电极表面的结合诱导变化。
高性能适配体传感器的开发在很大程度上依赖于电极界面的架构。尽管碳基纳米材料、双金属结构、有机框架等已成功增强电化学转导，但其复杂制备工艺和适配体附着的额外连接步骤仍是挑战。本研究选择N-苯基邻氨基苯甲酸（NPAA）——一种聚苯胺类似物——作为转导基底，因其能形成具有大量表面可及羧酸基团的电活性聚合物膜。电聚合过程中，聚NPAA的疏水性苯环促进其牢固附着于碳电极表面，同时聚合物向电解质中延伸出高密度的表面可及羧酸基团。NPAA的电聚合提供了可控膜厚度和用于生物偶联的固有支架，允许与胺末端适配体进行简化的单步碳二亚胺介导偶联，确保稳定的共价锚定。这种单步电聚合与偶联策略相比需要多步合成金属纳米颗粒、金属有机框架或双金属纳米结构等组分的纳米材料平台，降低了制备复杂性和材料成本，支持该平台用于大规模现场应用的实用性。此外，研究同时评估了传统全谱EIS和简化的单频方法用于PQ分析，以提高分析性能和操作效率。单点监测阻抗变化绕过了全谱频率扫描的耗时要求，显著缩短分析时间并提高未来研究的可行性。最终，本研究提升了EIS介导适配体传感器作为检测自然资源和商品中PQ污染的有前景替代方案的潜力，从而促进严格监管并增强环境与公共卫生安全。
二、主要关键技术方法
研究人员采用丝网印刷碳电极（SPCE，工作电极直径3.0 mm）构建三电极体系，通过循环伏安法（CV）在0.0至+1.0 V范围内以100 mV s?1扫描速率进行20次循环，电沉积3.0 mM NPAA形成聚合物膜；以0.4 M EDC和0.2 M NHS活化羧基60 min后，将经95 °C加热5 min、冰浴10 min活化的5.0 μM胺标记PQ-15适配体过夜共价固定，并以1% v/v乙醇胺（EA）封闭20 min。电化学测量采用PalmSens4恒电位仪，以5.0 mM [Fe(CN)6]3?/4?为氧化还原探针，CV在–0.4至+0.7 V范围内以0.1 V s?1扫描3次，EIS在0.1 Hz至200.0 kHz频率范围、–160.0 mV固定直流电位下记录。表面表征采用扫描电子显微镜（SEM）、能量色散X射线光谱（EDS）、光学接触角（OCA）分析和拉曼光谱。分子对接通过MFold、RNAComposer、YASARA和HDOCK服务器完成。实际样品为泰国玛希隆大学医学院采集的渠水及当地市场购买的香蕉和白菜，经离心预处理后以1:10体积比加标建立基质匹配标准曲线。
三、研究结果
3.1 适配体–PQ相互作用的分子对接研究
通过分子对接计算模型1至5的结合评分分别为?70.78、?70.40、?66.15、?66.12和?65.76，更负值表示更强预测结合，模型1为能量最有利构象。分析识别出PQ与适配体相互作用的两个潜在结合区域，提示灵活的 binding 环境。范德华力是稳定PQ–适配体复合物的主要贡献者，在所有预测模型中一致存在；涉及的非共价相互作用核苷酸残基包括A5、C6、C40、T41（模型1）等。氢键显著贡献于复合物稳定，PQ的N-甲基取代基与T45（模型1和2）和T12（模型3）形成氢键，作为PQ识别的关键受体位点；还观察到π–氢相互作用，C16的氢原子作为供体与PQ两个芳环作用（模型3和4）。这些非共价相互作用表明PQ结合涉及色散力和定向氢键力的组合，可能有助于适配体对PQ的高亲和力和特异性。
3.2 NPAA修饰SPCE的电聚合
NPAA可电化学氧化形成自由基阳离子中间体，进而氧化偶联形成聚NPAA。负电位应用会还原聚合物，导致非活性单体形成和聚合效率降低，因此通过正向扫描优化伏安循环数。第一循环在约+0.4 V出现强不可逆氧化峰，表明自由基阳离子生成和聚NPAA同时形成；后续循环氧化峰逐渐降低，最后五循环氧化峰稳定且几乎消失，表明母体化合物饱和生成并证实NPAA膜成功形成，故确定20次伏安循环为最佳扫描。在保持20次循环条件下优化NPAA浓度为0.5、3.0和5.0 mM，由于暴露于电解质的羧基排斥带负电的[Fe(CN)6]3?/4?氧化还原探针从而增加电荷转移电阻，更高电阻意味着更多活性羧基用于适配体固定；Rct随浓度增加并在3.0 mM时趋于稳定，更高浓度未显著改变电荷转移电阻，该平台可能源于电极表面被聚NPAA完全覆盖，故采用3.0 mM为最佳浓度，既确保最佳传感器性能又通过减少化合物用量降低制备成本。
3.3 制备适配体传感器的表征
SEM图像显示裸SPCE与NPAA修饰SPCE无显著差异，但裸SPCE在碳墨片状形貌边缘显示更高亮度，归因于碳特征更强的二次电子散射；聚NPAA修饰导致亮度降低，提示NPAA聚合物层覆盖并平滑了碳表面。元素分析显示修饰表面出现氮（N）元素，为NPAA分子结构固有元素，提供聚合物存在的化学确认。接触角测量中，裸SPCE表面水滴静态接触角为117.01° ± 0.88，表明碳材料固有疏水性；修饰NPAA后接触角显著降至76.27° ± 0.17，归因于NPAA羧酸部分的亲水性；适配体功能化后因亲水性磷酸骨架和含氮碱基进一步降至65.24° ± 0.10。拉曼光谱显示碳基质的特征D带（1350 cm?1，结构缺陷或无序）和G带（1585 cm?1，石墨化程度），ID/IG比值从0.86 ± 0.07增至0.95 ± 0.06，可能归因于聚合过程中碳晶格的结构缺陷或无序。循环伏安图显示裸SPCE上[Fe(CN)6]3?/4?的可逆氧化还原特征，初始峰间电位差（ΔEp）为0.24 V，阳极和阴极峰电流分别为80.70和–86.44 μA；NPAA聚合后峰电流急剧下降且ΔEp展宽，表明成功接枝，归因于带负电氧化还原探针与NPAA修饰电极表面羧酸盐之间的静电排斥；适配体通过酰胺偶联固定后排斥减弱，峰电流显著恢复。EIS研究证实该趋势，NPAA聚合后Nyquist图半圆增大，Rct从3,133.0增至15,640.0 Ω，表明形成电子转移势垒；适配体顺序偶联至活化羧基后Rct降低，半圆直径相应减小。表观电荷转移速率常数（Kapp）计算显示NPAA修饰后降低，归因于静电排斥阻碍界面电子转移，适配体固定后通过屏蔽羧酸盐部分恢复电荷转移效率，与CV和EIS结果一致。基于伏安响应估算的表面覆盖度在NPAA修饰和适配体修饰电极上分别为3.58(±0.32)×10?11和4.28(±0.26)×10?11 mol cm?2，适配体表面覆盖度为6.99(±0.13)×10?12 mol cm?2；EIS数据得出NPAA修饰电极3.44(±0.20)×10?11 mol cm?2和适配体固定后4.29(±0.49)×10?11 mol cm?2，适配体表面密度估计为8.42(±0.36)×10?12 mol cm?2，与CV测量值高度一致。
3.4 PQ检测实验参数优化
在固定PQ浓度1.0 μg mL?1下监测Rct变化优化关键测定条件。PQ-15适配体对pH波动敏感，过度酸性或碱性条件可能改变核苷酸碱基质子化状态，破坏稳定适配体–靶标相互作用所需的氢键和碱基堆积，故研究聚焦于pH 7.4受控条件下的检测能力验证。适配体浓度在1.0至10.0 μM范围内，5.0 μM时达到最大相对Rct，表明最佳表面密度使适配体有效饱和聚NPAA支架，实现最大靶标复合和随后的氧化还原探针阻碍；低于该阈值时适配体数量有限导致表面覆盖不完全和靶标复合减少，未占据区域促进电子转移导致电阻变化较低；高于5.0 μM时因密集适配体层内的空间位阻限制构象自由度而下降。靶标识别最佳时长在15至60 min范围内测试，短暴露时间仅导致相对Rct轻微增加，表明适配体与PQ相互作用不完全；45 min孵育产生最高电阻，表明最完全相互作用；45 min后信号响应轻微下降，因适配体–靶标结合是可逆过程，超过平衡后复合物可解离回单个组分。因此后续实验采用5.0 μM适配体固定SPCE和45 min靶标孵育时间。
3.5 PQ检测的阻抗研究
在最佳条件下用EIS研究灵敏度、特异性、重复性、重现性和稳定性。适配体传感器暴露于0.001至10.0 μg mL?1的PQ溶液，Nyquist谱中半圆弧随PQ浓度增加成比例增大，归因于适配体在靶标暴露后的构象重组，由范德华力和氢键协同作用驱动；结合事件有效屏蔽电极表面，阻碍氧化还原探针界面电子转移，导致浓度依赖性阻抗增加。阻抗随频率变化的对数图显示，低频下阻抗受电极–电解质界面电化学过程影响，如电荷转移反应、质量传输和双电层电容；高频下阻抗主要由Rs主导，且Rs在电极表面修饰过程中保持不变，因其代表整体电解质溶液和扩散性质；阻抗随频率增加而降低并在10.0 Hz以上趋于稳定，表明该高频区域Rct对PQ浓度不敏感。因此0.1至10.0 Hz被确定为检测PQ浓度变化引起阻抗变化的敏感区域，其中约1.8、2.9和4.8 Hz提供最明显的阻抗变化。1.8 Hz阻抗幅度虽初始显示比全谱分析更高灵敏度，但在所有浓度下表现出显著偏差，提示低频率下信噪比差；2.9 Hz测量的阻抗与全谱Nyquist图推导的Rct值呈最强线性相关，提供更稳健可重复的分析信号，故选择该频率为单频EIS分析最佳操作点。低频检测能力不仅消除耗时全谱扫描需求，还为便携式诊断设备开发提供优势，允许低功耗和降低硬件复杂度的高灵敏检测，显著延长现场可部署传感器的电池寿命。全谱分析线性回归方程为ΔRct/Rct = 0.052Log[PQ] + 0.283（R2 = 0.986），单频分析为ΔZ/Z0 = 0.039Log[PQ] + 0.275（R2 = 0.963）。基于3.3×(S/m)公式计算，全谱和单频分析的LOD分别为1.822和3.350 ng mL?1，足以覆盖最低最大残留限量（MRLs），包括食品法典委员会（CAC）0.005 μg mL?1标准和饮用水0.5 μg mL?1限量。与已报道平台相比，该分析性能具有高度竞争力。特异性评估中，单独干扰物测试未显示显著变化或剂量依赖性响应；干扰物与PQ等摩尔混合物暴露产生与单独PQ相似的响应，仅信号轻微下降，表明传感器对PQ具有特异性且不受这些化合物明显影响。重复性和重现性测试中，每批三个独立制备电极，批1和批2分别在不同日期制备，重复性%RSD分别为8.50和11.39%；两批共六个电极合并的重现性%RSD为10.28%，证实跨独立制备事件的一致性能。储存稳定性评估显示，4 °C干燥条件下7天和14天后性能显著下降，仅保留初始信号的50.97%和35.71%，提示当前界面在储存期间易受表面降解或环境污损影响，未来研究建议加入防污剂以减轻表面钝化并保持生物识别完整性。
3.6 加标实际样品分析
通过回收率研究验证实际样品分析可行性。为最小化基质效应，样品经预处理后加标，回收率范围为81.20%至115.10%，符合EU-SANTE推荐的70–120%范围。复杂基质中的信号波动可能归因于基质诱导的离子变化，可能破坏适配体–PQ相互作用或基质成分非特异性沉淀于传感表面。T检验分析（P = 0.05）显示所有浓度下计算t值均小于临界值（tcritical,2 = 4.30），表明加标与回收浓度间无统计学显著差异。测试的真实样品基质本身含有若干被确定为潜在交叉反应关注点的丰富组分，包括纤维素、天然植物蛋白和常见无机阳离子，作为其天然基质背景的一部分；这些基质中可接受的回收率和非显著t检验结果提供了间接证据，表明这些生物分子的非特异性吸附以及天然基质离子强度未显著损害所提出适配体传感器的定量性能。
四、结论
本研究展示了用于PQ检测的适配体传感器的开发。通过利用聚NPAA界面，研究人员实现了高密度羧酸支架，通过单步偶联简化了制备过程。阻抗研究的不同方面揭示了理想性能，在0.001至10.0 μg mL?1工作范围内实现了1.822和3.350 ng mL?1的显著LOD。在2.9 Hz实施单频EIS被证明是变革性进展，在保持宽线性范围和竞争性LOD的同时显著绕过了全谱扫描的耗时要求。这些发现突显了EIS作为电化学生物传感器开发领先技术的巨大潜力。此外，对常见干扰物的特异性和实际样品分析的可行性表明适配体用于PQ检测的有前景候选。值得注意的是，未来应用中仍有一些局限性有待解决：尽管已确认对常见农药干扰物和食品相关化合物的特异性，建议未来工作系统评估其他丰富基质组分（如纤维素、蛋白质等结构生物分子和Na+、K+、Ca2+、Mg2+等常见无机阳离子）的潜在交叉反应性，以更严格表征传感器对复杂真实基质的 selectivity 和稳健性；适配体对pH波动的构象敏感性要求使用受控缓冲液以保证可重复的现场性能；当前储存稳定性也突出需要先进防污涂层（如壳聚糖、聚乙二醇或海藻糖基质）或优化干燥储存条件（如干燥剂控制或真空密封包装）以延长传感器货架期；此外，鼓励与LC-MS和HPLC等常规方法比较以增强所提出适配体传感器的准确性。尽管存在这些局限性，研究结果证明了这种新型适配体传感器在PQ残留分析中的重要性，提供了潜在的替代分析方法，从而维护良好公共卫生并促进更严格的监管。
