《Journal of Biological Chemistry》：Identification of substrates for the skeletal muscle-specific lysine methyltransferases METTL21C and METTL21E
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蛋白质赖氨酸甲基化由依赖S-腺苷甲硫氨酸（AdoMet）的甲基转移酶（MTase）催化，在调控蛋白质功能中具有重要作用。哺乳动物同源赖氨酸特异性甲基转移酶METTL21C与METTL21E主要在骨骼肌表达，但其底物长期存在争议。研究人员发现，在METTL21C
蛋白质赖氨酸甲基化由依赖S-腺苷甲硫氨酸（AdoMet）的甲基转移酶（MTase）催化，在调控蛋白质功能中具有重要作用。哺乳动物同源赖氨酸特异性甲基转移酶METTL21C与METTL21E主要在骨骼肌表达，但其底物长期存在争议。研究人员发现，在METTL21C缺陷小鼠骨骼肌提取物中，METTL21C仅甲基化单一蛋白，即快肌肌球蛋白结合蛋白C（fMyBPC；基因MYBPC2）。重组fMyBPC在体外被METTL21C高效修饰，于Lys-242引入三甲基化（Kme3）。该甲基化事件在体内同样存在，并因Mettl21c敲除（KO）而消失。体外实验中METTL21C对fMyBPC的活性较已报道底物丙氨酰-tRNA连接酶AARS1高出两个数量级以上。另两种表达于心肌与慢肌的MyBPC旁系同源蛋白不被METTL21C甲基化。对于METTL21E，研究人员未检测到其体外活性；但发现脊椎动物肌肉中保守的肌球蛋白重链（MYH）Lys-35（K35）单甲基化在小鼠肌肉中因Mettl21e KO而完全消失，而不受Mettl21c KO影响。人肌肉中MYH-K35甲基化水平与小鼠相似，提示人类METTL21E作为假基因（METTL21EP）的注释需重新评估。综上，研究明确fMyBPC为METTL21C的确定性肌肉特异性底物，并证明METTL21E是MYH-K35甲基化所必需的甲基转移酶。
研究背景与立项依据
蛋白质赖氨酸甲基化是依赖S-腺苷甲硫氨酸（AdoMet）的甲基转移酶（MTase）所催化的关键翻译后修饰，可精细调控非组蛋白功能。METTL21家族属甲基转移酶家族16（MTF16）的7β链（7BS）亚类，其中METTL21A、METTL21B与METTL21D的底物与功能已基本阐明，而同样骨骼肌特异表达的METTL21C与METTL21E底物长期存在矛盾报道：前者曾被指认靶向VCP、HSPA8或AARS1，后者仅见薄弱的VCP体外活性证据。骨骼肌由慢（Ⅰ型）与快（Ⅱ型）纤维构成，肌球蛋白重链（MYH）及肌球蛋白结合蛋白C（MyBPC）旁系同源蛋白具有纤维类型特异性。五十年前已发现脊椎动物MYH存在赖氨酸甲基化（K35、K130、K554等位点），但催化酶始终未明。因此，鉴定METTL21C/E的真实生理底物、厘清其与肌原纤维蛋白修饰的关系，是理解骨骼肌表观酶学机制的核心缺口。
研究人员以“底物在缺陷型肌肉中呈去甲基态、回补酶后显影”为策略，利用METTL21C与METTL21E缺陷小鼠及重组酶体系，系统筛查肌原纤维蛋白甲基化图谱，最终确立fMyBPC为METTL21C确定性底物，并证明METTL21E负责MYH-K35单甲基化，纠正了既往争议并重启对人METTL21E假基因状态的再评估。
主要关键技术方法
研究人员采用METTL21C与METTL21E双缺陷（Mettl21e KO，伴随METTL21C蛋白缺失）及Mettl21c单KO小鼠骨骼肌，配合人股外侧肌活检样本；通过肌浆网与肌原纤维分级提取降低样本复杂度；以氚标记AdoMet（[3H]AdoMet）体外甲基转移酶反应联合氟显影定位靶带；对显影条带行质谱（MS）鉴定与定点突变刻画位点；以嵌合体MyBPC构建解析底物识别结构基础；最后用胆碱蛋白酶切肽段的非标定量质谱比较小鼠及人肌肉中MYH多位点甲基化占用率。
研究结果
METTL21C methylates a protein of ～150 kDa
研究人员在快肌（EDL、腓肠肌）肌原纤维分级中，以重组METTL21C处理KO小鼠提取物，氟显影检出约150 kDa单一强信号，失活突变体D125A无活性，且WT提取物信号更弱，符合体内已甲基化底物特征。质谱鉴定该带为快肌肌球蛋白结合蛋白C（fMyBPC/Mybpc2），信号强度居首。
METTL21C catalyzes methylation of K242 in fMyBPC in vitro and in vivo
以重组fMyBPC分段实验将修饰定位于N端；质谱显示238–253肽段携带三个甲基，集中K241/K242。丙氨酸/精氨酸扫描中仅K242R完全消除甲基化，确定K242为主修饰位。体内TA肌样本中，WT小鼠该肽段仅存三甲基态，Mettl21c KO仅存未甲基态，证实METTL21C负责fMyBPC-K242三甲基化。
METTL21C has a distributive mode of action
梯度酶量实验显示：高浓度下肽段近完全三甲基化，中浓度出现Me0/Me1/Me3混合，几乎无Me2与更高态，说明METTL21C为分布式（distributive）催化，单次结合仅加一甲基，最终在K242累积为Kme3。
METTL21C does not methylate sMyBPC or cMyBPC in vitro
慢肌（sMyBPC）与心肌（cMyBPC）同源片段不被甲基化；即便将对应位置突变为赖氨酸（R230K、G350K）或移植fMyBPC六残基局部序列，仍无活性，表明识别依赖超越局部线性表位的立体界面，而非单一K残基。
fMyBPC is a better METTL21C substrate than AARS1
人鼠METTL21C均高效甲基化fMyBPC，对人fMyBPC稍弱于鼠但远强于AARS1；达到同等修饰需逾百倍酶量作用于AARS1，且鼠AARS1几乎不被修饰。fMyBPC方为生理相关优势底物。
Myosin heavy chain (MYH) K35 methylation depends on Mettl21e function
质谱伪定量分析显示：WT快肌MYH1/MYH4-K35部分单甲基化（约35–60%），Mettl21e KO中完全消失；MYH7（心肌对应位K34）无甲基化，K130/K552三甲基不受KO影响。Mettl21c单KO保留K35甲基化，证明该修饰专依赖Mettl21e。
MYH-K35 is methylated in human skeletal muscle
人股外侧肌活检中，MYH1、MYH2及MYH7均检出K35单甲基化，占用率个体差异大（约25–100%）。鉴于小鼠中METTL21E为必需酶，人肌同位点修饰提示METTL21E假基因注释（METTL21EP）应重新审订。
讨论与结论翻译
讨论指出，研究确立fMyBPC为METTL21C首要生理底物，修饰位于M结构域邻近肌动蛋白互作模体（LKRLK/LKKAK），可能影响快肌收缩调控；METTL21E虽无直接体外活性，却是MYH-K35甲基化不可替代的催化者。意外发现Mettl21e缺失连带导致METTL21C蛋白消失，暗示两基因共调控。人METTL21E低表达但因肌肉蛋白更新慢仍足以维持修饰。
研究结论：METTL21C确定性底物为快肌fMyBPC，催化其K242三甲基化；METTL21E为MYH-K35单甲基化所需之甲基转移酶；人METTL21E应脱离假基因归类。该工作为骨骼肌蛋白质甲基化图谱补入两个关键生理节点，并重划METTL21亚家族的底物逻辑与疾病/肌生理研究方向。
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