大叶余甘子与余甘子（Phyllanthus emblica L.）的遗传特征、植物化学分析及抗氧化与伤口愈合活性评价

《Scientific Reports》：Genetic Characterization, phytochemical analysis and evaluation of the antioxidant and wound healing activities of Phyllanthus angustifolius Sw. and Phyllanthus emblica L

　　

对Phyllanthus angustifolius Sw.与Phyllanthus emblica L.的遗传特征、植物化学组成、抗氧化能力及体外划痕闭合活性进行比较性表征。研究采用靶向查尔酮 synthase（CHS）、肉桂酸4-羟化酶（C4H）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）及D-半乳糖醛酸还原酶（GalUR）的引物进行遗传特征分析。虽然两个物种对关键生物合成基因均产生阳性扩增产物，但在苯丙氨酸解氨酶（PAL）位点的PCR扩增模式上观察到明显差异。这些变异反映的是遗传多样性而非基因功能缺失，提示需通过测序和表达分析来阐明代谢调控机制。比色法显示，P. angustifolius的总黄酮含量较高，而P. emblica的总单宁含量较高。HPLC-DAD分析鉴定出多种酚酸和黄酮类化合物，其中没食子酸和槲皮素为主要鉴定成分。在DPPH、ABTS和FRAP实验中，P. emblica表现出更强的抗氧化活性，且在测试条件下划痕闭合能力强于P. angustifolius。值得注意的是，P. emblica较强的抗氧化和划痕闭合反应与其整体植物化学特征的差异相一致，包括其较高的单宁含量和显著更高的没食子酸含量，而P. angustifolius较高的总黄酮含量并未对应更强的抗氧化或划痕闭合活性。这些发现提示，所观察到的生物学差异可能反映的是整体植物化学成分的综合贡献，而非某一单一化合物类别的丰度。尚需进一步的机制研究和体内研究以确定 contributing 于这些活性的成分和通路。

**研究背景与问题**

正常代谢及环境氧化剂暴露等因素可导致内源性和外源性自由基的形成。线粒体呼吸链产生的活性氧（ROS），包括过氧化氢（H₂O₂）、超氧阴离子（O^?₂）或过氧化物（O^2?₂），是导致细胞损伤、疾病、糖尿病、艾滋病、关节炎、免疫缺陷、神经退行性疾病、阿尔茨海默病、炎症以及愈合过程失调的主要因素。伤口修复是一个复杂但动态有序的过程，以一系列重叠阶段为特征，始于凝血，随后是免疫反应、炎症、增殖，最后是重塑。该过程的紊乱会影响愈合，导致慢性伤口。抗氧化剂不仅可作为ROS清除剂将其转化为更稳定的分子并保护细胞免受氧化损伤，还能减轻炎症，对伤口愈合从炎症期向增殖期的过渡过程至关重要。此外，抗氧化剂支持成纤维细胞和角质形成细胞的增殖与迁移，这些细胞负责组织形成和伤口闭合。P. emblica（Emblica officinalis，Amla，印度醋栗）属于叶下珠科，在阿育吠陀医学中备受重视，其所有部位（果实、花、种子、叶和树皮）均被广泛用于众多传统疗法。其果实、种子和树皮含有多种有益化合物，如固定油、脂肪酸、酚类化合物、木脂素和维生素C，具有广泛的生物活性，包括抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、细胞保护和抗病毒特性。其他药理特性包括抗黄疸、抗血脂异常、抗衰老、抗凋亡、抗炎、保肝、保肾以及降糖或抗糖尿病活性。然而，尽管其叶片具有潜在治疗价值，却仍研究不足。本研究强调P. emblica叶片作为一种新的、可获取且经济有效的生物活性化合物来源，通过利用植物废弃物用于潜在医学用途，促进可持续实践。遗传多样性分析为生物活性化合物产生的遗传基础提供了宝贵见解。PCR和测序等分子技术为理解遗传变异和确保植物物种及栽培品种的正确鉴定提供了精确方法。理解植物代谢物的生物合成途径可为其遗传和植物化学多样性提供见解。在黄酮生物合成的关键酶中，苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸4-羟化酶（C4H）、4-香豆酸-CoA连接酶（4CL）和查尔酮 synthase（CHS）引领着关键黄酮前体的产生。同样，维生素C的生物合成涉及甲基-D-半乳糖醛酸转化为D-半乳糖醛酸，再通过D-半乳糖醛酸还原酶（GalUR）进一步转化为L-半乳糖酸-1,4-内酯。尽管关于P. emblica的药理学和植物化学文献丰富，但关于P. angustifolius的信息相对有限，特别是其植物化学特征和生物学特性与表征更充分的P. emblica的直接比较方面。因此，在相同实验条件下进行比较评估可能有助于区分物种特异性的化学和生物学特征，并为P. angustifolius的进一步研究提供初步科学依据。据此，本研究设计通过互补的遗传、植物化学、抗氧化、营养和体外划痕闭合评估来比较这两个物种。

**主要关键技术方法**

研究人员采集了P. angustifolius和P. emblica叶片（采自埃及吉萨/开罗El-Barageel的Shehab Mazhar植物园，坐标为北纬30.042689°，东经31.245618°，采样时间为2020年8月开花期），凭证标本保存于开罗大学药学院生药学系标本馆（凭证号18-05-2022I和18-05-2022II）。采用改良Carlson裂解法提取总基因组DNA，利用靶向CHS、C4H、PAL和GalUR基因的引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离。采用SDS-PAGE进行细胞蛋白图谱分析。植物化学分析采用70%甲醇浸提法制备提取物，通过比色法测定总黄酮和总单宁含量，采用HPLC-DAD进行靶向酚类成分定量分析，并测定维生素（C、A）和矿物质含量。抗氧化活性采用DPPH、ABTS和FRAP三种互补实验评估。伤口愈合活性采用人皮肤成纤维细胞（HSF）进行WST-1细胞增殖实验和体外划痕闭合实验。

**研究结果**

**植物化学分析**

黄酮和单宁定量：P. angustifolius的总黄酮含量较高（128.1 mg QE/g干提取物），而P. emblica较低（68.1 mg QE/g干提取物）。单宁含量方面，P. angustifolius为34.62 mg TAE/g干提取物，P. emblica为36.75 mg TAE/g干提取物。HPLC分析共鉴定和定量了19种酚类化合物，包括6种黄酮和13种酚酸。没食子酸是主要的酚酸，在P. angustifolius和P. emblica中分别为2631.36和10300.42 μg/g（约0.26%和1.03% w/w）；槲皮素是主要鉴定的黄酮，分别为598.56和184.5 μg/g（0.06%和0.018% w/w）。

维生素含量测定：P. angustifolius的维生素C含量较高（82.49 mg/kg），而P. emblica的维生素A含量较高（52.75 IU）。

矿物质含量测定：在干重基础上，P. angustifolius的锌、硒、铜和镁含量高于P. emblica。

**生物学研究**

抗氧化潜力测定：DPPH实验中，P. angustifolius的IC₅₀为15.73 ± 0.02 μg/mL，P. emblica为9.18 ± 0.02 μg/mL。ABTS实验中，P. emblica表现出显著活性，达到3607.95 ± 286.78 μM TE/mg。FRAP实验中，P. angustifolius和P. emblica的值分别为1366.16 ± 101.10和1709.38 ± 86.03 μM TE/mg。值得注意的是，抗氧化活性并不完全与总黄酮含量平行。尽管P. angustifolius总黄酮含量较高，但P. emblica在DPPH、ABTS和FRAP实验中均表现出更强的活性。这种差异可能反映提取物更广泛的植物化学成分（包括酚酸、黄酮、单宁和其他成分）的贡献，而非任一单一化合物或化合物类别的丰度。

伤口愈合活性：WST-1实验显示，P. angustifolius在100 μg/mL时细胞活力较高（70.43%），而P. emblica为42.20%。基于初步WST-1活力评估，选择80 μg/mL作为亚细胞毒性浓度用于划痕实验。划痕实验结果表明，P. emblica叶提取物在80 μg/mL时72小时内闭合划痕间隙的63.87%，而P. angustifolius为56.72%，伤口宽度分别为0.75 ± 0.21和0.25 ± 0.07，划痕闭合率分别为0.02和0.02。尽管初始伤口宽度较大，P. emblica实现了更高的伤口闭合百分比。这可能归因于P. emblica刺激更强增殖反应的能力，导致新细胞快速填充伤口区域，与较小的伤口面积相关。此外，P. emblica的抗氧化特性可能更有效地增强细胞外基质（ECM）产生和重塑过程，从而导致更快的伤口收缩和闭合。

**遗传特征**

细胞蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳：SDS-PAGE分析显示，P. angustifolius和P. emblica的细胞蛋白谱大体相似，同时存在若干条带分布和强度的差异。共享的主要条带表明两个物种可检测细胞蛋白谱的相似性，而物种特异性条带的存在表明其蛋白质模式的差异。这些差异可能反映两个物种细胞蛋白组成的变异；然而，SDS-PAGE图谱被解释为定性蛋白质模式差异，而非差异基因表达或特定蛋白质丰度的证据。

聚合酶链反应（PCR）：对GalUR基因的引物调查显示两个物种均存在明显条带，在100和150 bp标记之间出现阳性条带，表明GalUR基因（维生素C生物合成的关键基因）的存在。对于PAL的PCR分析，P. angustifolius显示明显的扩增产物，在50、100和250 bp处有条带；而P. emblica在75、100和175 bp处显示条带，表明两个物种PAL扩增谱的差异。对于C4H，两个物种均显示阳性条带，表明C4H基因的存在，但条带强度不同，P. angustifolius显示更强的扩增产物。对于CHS的PCR分析，两个物种均显示阳性条带，P. angustifolius在75和约125 bp处出现两条带，而P. emblica在100和200 bp处观察到条带。在P. angustifolius和P. emblica中观察到CHS基因的明显扩增产物或大小变异。这种遗传多样性可能与插入、缺失或基因内含子或外显子区域的变异有关，导致不同长度的PCR产物。此外，每个物种中多条带的存在也可能提示基因组中存在多个基因拷贝或密切相关的旁系同源基因。这些结果表明，在测试条件下，P. angustifolius和P. emblica之间PAL靶序列的PCR扩增谱存在明显差异。然而，常规终点基因组PCR表明的是序列扩增行为，而非基因缺失、表达水平或活跃生物合成通量。因此，这些扩增模式变异不应被解释为替代或补偿性生物合成途径的 definitive 证据，需要未来通过转录组学和酶学研究进行验证。

**讨论与结论**

本研究提供了P. angustifolius和P. emblica植物化学特征、体外生物学活性和遗传鉴定的综合比较分析。植物化学分析揭示P. angustifolius具有较高的黄酮含量（经高槲皮素含量证实），而P. emblica具有较高的单宁含量（与高没食子酸含量相关）。此外，P. angustifolius表现出较高的维生素C、硒和锌含量，而P. emblica具有较高的维生素A含量。伤口愈合实验表明，P. emblica叶提取物产生的间隙闭合百分比高于P. angustifolius。这些结果与DPPH、ABTS和FRAP实验证实的较高抗氧化活性良好相关。虽然两个物种均表达参与黄酮生物合成的关键酶，但在所应用的实验条件下，两个物种之间苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因的PCR扩增模式存在明显变异。这些谱图变异提示P. emblica中可能存在替代生物合成途径或补偿机制。两个物种均表达查尔酮 synthase（CHS）和肉桂酸4-羟化酶（C4H），表明它们参与黄酮生物合成途径。虽然两个物种均表现出CHS和C4H的阳性PCR扩增，但注意到PAL扩增模式的明显差异。这些谱图差异证明了测试位点的遗传多样性；然而，功能和测序分析对于确定其代谢意义仍然至关重要。本研究不仅强调了P. emblica的药用重要性，还引入了P. angustifolius作为药理学感兴趣的研究对象。通过阐明这些物种的化学和生物学特征，研究人员为未来研究探索其治疗作用的潜在机制和识别活性化合物奠定了基础。