《Nature Communications》：Systematic screen of RNA binding proteins that enhance circular RNA translation
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可翻译环形RNA（circRNA）因具备更高稳定性与更长表达窗口，有望成为传统信使RNA（mRNA）治疗的替代平台。circRNA的翻译主要由内部核糖体进入位点（IRES）或类IRES元件驱动，并受到多种反式作用RNA结合蛋白（RBP）的严格调控。研究人员开发
可翻译环形RNA（circRNA）因具备更高稳定性与更长表达窗口，有望成为传统信使RNA（mRNA）治疗的替代平台。circRNA的翻译主要由内部核糖体进入位点（IRES）或类IRES元件驱动，并受到多种反式作用RNA结合蛋白（RBP）的严格调控。研究人员开发了一种基于细胞的系统，用于系统性筛选能够增强circRNA翻译的RBP，鉴定出68个非经典翻译的潜在激活因子。这些翻译激活因子广泛参与RNA加工、核糖体生物合成及翻译起始等生物学过程。研究人员进一步设计机器学习算法，提取这些激活因子的共同序列特征，并预测更多具有翻译激活潜力的RBP。新鉴定与预测的激活因子经实验验证，可在依赖特定语境的方式下促进IRES介导的circRNA翻译。该研究深化了对IRES相关反式作用因子的认识，并为RNA合成生物学中工程化RBP工具箱提供了扩展。
研究背景与总体结论
环形RNA（circRNA，共价闭合单链RNA）因稳定性高、免疫原性低，被视为新一代RNA治疗载体。其蛋白表达主要依赖内部核糖体进入位点（IRES，internal ribosome entry site）或类IRES元件启动非帽依赖翻译（cap-independent translation），但该过程受反式作用因子（trans-acting factors）即IRES反式作用因子（ITAF，IRES trans-acting factor）调控，而此前领域对能够增强circRNA翻译的RBP谱系知之甚少。研究人员在《Nature Communications》发表研究，构建基于荧光素酶（Fluc/Rluc）的环形报告系统与PUF（Pumilio and FBF homology）锚定文库，对人源核糖体关联RBP进行系统筛选，鉴定出68个翻译激活子，并结合增强交联免疫沉淀（eCLIP）数据与稀疏偏最小二乘判别分析（sPLS-DA）模型预测新因子，最终揭示这些因子可作为新型ITAF，在特定IRES语境下提升circRNA翻译效率。
主要关键技术方法
研究以HEK 293T细胞为模型，采用分割荧光素酶环形报告基因与互补内含子反向剪接成环，嵌入PUF识别位点实现RBP定位锚定；构建110个全长和截短RBP的PUF融合文库，同步定量环形RNA丰度、反剪接效率与翻译效率（TE）；利用eCLIP峰注释分析RBP在5'UTR、CDS、3'UTR的分布及与已知IRES重叠；通过RNA免疫沉淀结合qPCR（RIP-qPCR）验证内源靶标与基序招募；以慢病毒敲低构建稳定细胞系；并基于单肽/二肽/三肽频率训练sPLS-DA分类模型，在7折交叉验证下预测全人RBP组未知激活子。
研究结果
构建报告系统评估RBP对circRNA翻译的调控
研究人员工程化反向分段Fluc环形报告系统，确认PUF锚定而非单纯过表达才可驱动翻译增益，验证eIF4E与eIF4G2作为阳性对照，建立可区分环形RNA生物合成与翻译步骤的定量流程。
系统筛选影响circRNA翻译的RBP
对110个候选RBP进行文库筛查，校正反剪接贡献后，以相对TE≥1.3为阈值锁定68个翻译激活子；聚类显示其富集于翻译起始、RNA剪接与核糖体生物合成，且多数定位于核质穿梭并关联应激颗粒与P体。
已鉴定翻译激活子的ITAF样特征与功能
比对已知ITAF库，14个为已报道ITAF，54个为新发现；eCLIP分析显示激活子偏好结合5'UTR/3'UTR，部分与IRES区域重叠。以LARP7为例，将其内源结合基序植入报告RNA，RIP-qPCR证实招募，过表达提升TE，敲低则特异下调，证明基序导向的内源因子招募可驱动IRES依赖翻译。
新鉴定激活子中的功能模块
对12个代表蛋白做N端/C端截短测试，发现DDX21、eIF5B、RBM28、SRRM1等部分片段可复刻全长活性；序列比对显示激活子按氨基酸组成聚类，注释结构域不能单独预测功能，暗示无序区与短肽构成决定活性。
开发机器学习模型预测新激活子
以110个RBP肽频矩阵训练sPLS-DA，交叉验证准确率超70%；模型在1432个已知RBP中预测398个新激活子，实验验证DEK、PAIP2B、eIF3J等8个候选均具促翻译能力，并提示赖氨酸、亮氨酸等残基富集特征。
激活子作为ITAF以IRES特异方式促进circRNA翻译
在CVB3、EMCV、HCV、CSFV四类病毒IRES环形报告中，DDX21、eIF3D、LARP7及预测因子呈现明显IRES类型选择性，证实反式因子活性高度依赖IRES结构语境。
讨论与结论翻译
讨论指出，优化circRNA翻译不能仅依赖顺式元件工程，反式RBP图谱同样关键。锚定筛选虽为人工系统，但揭示了ITAF组合使用的设计原则：匹配IRES类型与细胞特异表达谱可提升治疗性circRNA产出。LARP7等因子通过内源基序招募、截短片段保留活性、序列特征可预测等发现，为可编程工程化RBP提供模块基础。部分RBP同时抑制反剪接但促进翻译，提示在体外环化RNA场景中仍具应用价值。
研究人员总结结论如下：该研究通过细胞系统筛选鉴定出一批可增强非帽依赖circRNA翻译的RBP激活子，证明其具有ITAF样、IRES语境依赖功能；机器学习进一步从序列特征外推未知激活子并得到实验支持。工作扩展了cap-independent翻译调控因子图谱，为环形RNA治疗平台的翻译效率工程化提供了新工具与设计逻辑。
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