《Discover Nano》：Chitosan functionalized selenium nanoconjugates of Mucuna pruriens as a nanotherapeutic approach for Parkinson’s disease
天然界蕴含大量尚未开发的植物化学成分资源，这些成分可对多种疾病发挥治疗活性。刺毛黧豆（Mucuna pruriens，MP）种子是左旋多巴（Levodopa，L-DOPA）最丰富的天然来源。L-DOPA是多巴胺（dopamine）的前体，而多巴胺是帕金森病（Parkinson‘s disease，PD）患者脑内缺乏的关键神经递质。L-DOPA在穿越血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）之前发生外周降解，是PD患者治疗中面临的最大挑战。多项临床前和临床研究报道了MP种子提取物的优异疗效。为递送MP种子提取物的关键成分，该研究工作设计了一种包含微量元素（硒）、天然多糖聚合物（壳聚糖）和MP种子提取物的纳米复合材料。在利血平诱导的PD大鼠模型中，研究人员以两个剂量水平（25和50 mg•kg?1）评估了壳聚糖@硒刺毛黧豆纳米颗粒（Chitosan@selenium Mucuna pruriens NPs，CSMNPs）的疗效，并与MP提取物和刺毛黧豆硒纳米颗粒（selenium NPs of Mucuna pruriens，MSNPs）进行了比较。表面修饰的聚合物金属纳米颗粒在利血平诱导的PD大鼠模型中显著改善了运动功能、握力和抗氧化水平。与MP提取物和MSNPs相比，CSMNPs表现出更好的抗帕金森病和抗氧化特性，这可能归因于其更小的尺寸和更好的BBB通透性。大脑海马区和黑质致密部的组织病理学评估也支持了CSMNPs的结果。
帕金森病（PD）是仅次于阿尔茨海默病的第二大常见神经退行性疾病，主要以进行性运动功能障碍为特征，包括震颤、僵直、运动迟缓和姿势不稳。PD的病理生理学主要与黑质致密部多巴胺能神经元的进行性变性有关，导致纹状体内多巴胺耗竭。由于多巴胺在基底神经节回路调控中发挥核心作用，其耗竭会破坏运动控制并导致PD中观察到的特征性运动异常。此外，错误折叠的α-突触核蛋白以路易小体形式积累和聚集被认为是PD的主要组织病理学标志。线粒体功能障碍、氧化应激、神经炎症、兴奋性毒性和蛋白质清除受损等多个相互关联的机制进一步促进神经元损伤和疾病进展。PD还可能涉及非运动表现，包括认知障碍、睡眠障碍、情绪改变、自主神经功能障碍和嗅觉异常。PD的发病率在全球范围内存在差异，并随年龄增长而增加。根据WHO 2019年数据，全球超过850万人受PD影响。由于全球人口老龄化，预计到2030年PD患病率将翻倍，使其成为日益重要的公共卫生问题。目前，PD的药物治疗主要集中于症状缓解。左旋多巴（L-DOPA）仍是金标准疗法，通常单独使用或与卡比多巴联合使用以增强中枢多巴胺可利用度。长期使用左旋多巴还与运动障碍、运动波动、幻觉和疗效随时间降低等并发症相关。多巴胺激动剂、单胺氧化酶-B（MAO-B）抑制剂、COMT抑制剂和抗胆碱能药物等其他疗法可暂时改善运动症状，但不能阻止疾病进展，凸显了需要更安全、更有效的PD神经保护策略。
刺毛黧豆（Mucuna pruriens (L.) DC.，MP），俗称天鹅绒豆，是豆科（Fabaceae）一年生攀援性豆科植物，原产于印度。它含有多种生物活性化合物，包括血清素、黧豆素和蛋白质。M. pruriens种子是L-DOPA的天然来源，L-DOPA是一种强效神经递质和罕见的非蛋白氨基酸。MP种子因其多巴胺增强特性传统上被用于PD的管理。据报道，MP种子具有抗僵直症和抗帕金森病活性，通常含有4–6%的L-DOPA。体外研究表明，MP种子显著增强脑线粒体复合物I的活性，而不影响总单胺氧化酶活性，这归因于辅酶Q-10和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的存在。此外，研究发现MP种子粉末比合成L-DOPA治疗更有效地恢复黑质中L-DOPA、多巴胺、去甲肾上腺素和血清素的内源性水平。然而，目前尚无标准化程序来确保MP提取物的纯度和效力。
纳米颗粒（NPs）是用于大脑的最有效和强效的药物递送系统。它们以更有效的靶向性将治疗剂递送至受损区域。硒（Se）是必需的微量元素，在众多生理过程中发挥基本功能。它是硒蛋白的关键元素，如谷胱甘肽过氧化物酶（GPx），通过将脂质和过氧化氢（H
2O
2）转化为安全化合物来保护细胞免受氧化损伤。Se NPs可通过诱导与PD相关的钙信号通路来减少大脑中的氧化损伤。由于其抗氧化特性，Se NPs正在被研究用于PD的潜在应用。
特别是，聚合物NPs可作为脑靶向药物递送系统，以促进亲水性和疏水性药物的控制释放和递送。壳聚糖（CS）是一种天然多糖，主要用于NPs的合成。CS因其黏膜粘附特性、低毒性、生物相容性和生物可降解性而在合成聚合物NPs方面受到越来越多的关注。当其脱乙酰度低于70%时，其生物降解速度更快。CS及其在NPs上的表面修饰提供了众多优势，包括改善药物吸收和控制药物释放。此外，CS包覆减少了药物的突释。阴离子质膜与阳离子CS之间的相互作用使NPs更多地渗透和滞留。低分子量CS比高分子量CS具有更好的水溶性。CS的包封效率随分子量降低而增加。
MP种子已被证实具有抗帕金森病活性。较差的稳定性、生物利用度和有限的血脑屏障（BBB）渗透性限制了M. pruriens在PD管理中的临床应用。研究人员已合成并研究了金属和聚合物NPs以克服这些局限性，提高其疗效和安全性。因此，研究人员假设CS包覆的MP种子提取物Se NPs可能通过改善药物跨BBB递送、减少氧化应激和促进神经元存活来增强MP种子提取物在大鼠中的抗帕金森病疗效。
本研究旨在制备含有壳聚糖和硒偶联刺毛黧豆纳米颗粒（CSMNPs）的聚合物-金属NPs，并研究其在利血平诱导的PD大鼠模型中的疗效。MP水提物的Se纳米颗粒（MSNPs）采用化学还原技术制备，随后将金属NPs与CS偶联以增强稳定性、生物利用度和BBB通透性。该研究还包括使用体内和体外方法评估CSMNPs的抗氧化功效，以及AChE和亚硝酸盐水平的生化测定。此外，通过利血平诱导的PD大鼠模型中的神经行为学评估来评价PD症状的改善情况。
研究人员开展了以下研究：采用微波辅助提取法从MP种子中提取L-DOPA，通过UV-visible分光光度法进行定性和定量分析；采用绿色合成法制备MSNPs，并通过壳聚糖包覆制备CSMNPs；使用UV-visible分光光度计、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、流体动力学直径、表面电荷和稳定性测定、X射线衍射（XRD）以及高分辨透射电子显微镜（HRTEM）联合选区电子衍射（SAED）成像对NPs进行表征；测定L-DOPA在NPs中的包封率（EE）和载药量（LC）；采用DPPH和ABTS自由基清除的体外模型评估抗氧化活性；在利血平诱导的PD大鼠模型（48只成年Wistar大鼠，随机分为8组）中评估神经药理学参数（握力测试和僵直症测试）、体内抗氧化指标（SOD、MDA、CAT、GSH）、亚硝酸盐水平以及海马区和黑质部的组织病理学变化。研究结论表明，MP提取物（50 mg•kg
?1，p.o.）、MSNPs（25和50 mg•kg
?1，p.o.）和CSMNPs（25和50 mg•kg
?1，p.o.）在利血平（0.2 mg•kg
?1，i.p.）诱导的PD大鼠模型中均表现出抗帕金森病特性。CSMNPs（50 mg•kg
?1）在改善行为学、生化和组织病理学参数方面表现出比MP提取物和MSNPs更好的抗帕金森病和抗氧化效果。聚合物修饰的金属纳米复合材料增强了MP提取物的功效和效力，与粗MP种子提取物和单独金属NPs相比表现出显著的抗帕金森病效果。该研究的重要意义在于，通过将硒纳米颗粒与壳聚糖和MP种子提取物结合，开发了一种有前景的纳米治疗策略，可改善L-DOPA的BBB通透性、减少氧化应激并促进神经元存活，为PD治疗提供了新思路。
研究方法概述：研究人员采用微波辅助提取法从MP种子中提取L-DOPA，通过UV-visible分光光度法进行定量分析（L-DOPA含量为27.5% w/w）；采用化学还原法绿色合成MSNPs，并通过壳聚糖包覆制备CSMNPs；使用UV-visible光谱、FTIR、Zeta sizer（流体动力学直径、PDI、Zeta电位）、XRD和HRTEM-SAED对NPs进行表征；通过离心法测定EE和LC；采用DPPH和ABTS体外模型评估抗氧化活性；在利血平诱导的PD大鼠模型（48只成年Wistar大鼠，8组，每组6只用于行为学测试，n=3用于生化测试，n=3用于组织病理学）中评估神经行为学（握力测试、僵直症测试）、体内抗氧化指标（SOD、MDA、CAT、GSH）、亚硝酸盐水平及海马区和黑质部的组织病理学变化。
研究结果：（1）MP种子提取物的制备与L-DOPA定量：通过微波辅助提取法从MP种子中提取L-DOPA，UV-visible光谱叠加鉴定提取物中L-DOPA的存在，定量测定L-DOPA含量为27.5% w/w。（2）MSNPs和CSMNPs的合成：MSNPs合成过程中颜色从灰色变为橙色（30 min内），SPR峰在263 nm处确认MSNPs的合成；CSMNPs合成过程中颜色从橙色变为浅粉色，SPR峰在294 nm处确认CSMNPs的合成。（3）MP提取物、MSNPs和CSMNPs的表征：UV-visible光谱显示MP提取物、MSNPs和CSMNPs的λmax分别为281 nm、263 nm和294 nm；FTIR光谱显示CSMNPs具有特征性功能团吸收带（3334 cm
?1为-OH伸缩振动，1634 cm
?1为C=O伸缩振动，1477 cm
?1和1379 cm
?1为芳香C=C和C-O伸缩振动）；MSNPs的流体动力学直径为278.50 nm，PDI为0.207，Zeta电位为?28.68 mV；CSMNPs的流体动力学直径为684.6 nm，PDI为0.977，Zeta电位为+40.91 mV；XRD显示CSMNPs为无定形材料；HRTEM显示MSNPs为球形，尺寸范围9.62–25.76 nm，CSMNPs为球形，尺寸范围6.71–13.22 nm；SAED显示MSNPs为多晶特性，CSMNPs为无定形特性。（4）L-DOPA在MSNPs和CSMNPs中的EE和LC：MSNPs的EE为75.46±2.48%，LC为32.15±1.89%；CSMNPs的EE为87.62±2.56%，LC为35.85±1.97%。（5）体外抗氧化研究：DPPH清除实验中，抗坏血酸、MP提取物、MSNPs和CSMNPs的IC50值分别为6.25±1.25 μg/mL、18.94±2.05 μg/mL、12.61±1.87 μg/mL和8.01±1.28 μg/mL；ABTS清除实验中，IC50值分别为2.35±1.32 μg/mL、12.85±1.51 μg/mL、9.29±0.98 μg/mL和5.13±1.34 μg/mL；MP提取物、MSNPs和CSMNPs均表现出剂量依赖性抑制。（6）神经药理学参数评估：握力测试中，利血平显著降低大鼠握力（p<0.05），L-DOPA（100 mg•kg
?1）、MP提取物（50 mg•kg
?1）、MSNPs（25和50 mg•kg
?1）和CSMNPs（25和50 mg•kg
?1）均显著逆转利血平效应（p<0.05）；CSMNPs（50 mg•kg
?1）握力显著强于MP提取物、MSNPs（25和50 mg•kg
?1）和CSMNPs（25 mg•kg
?1）（p<0.05）；僵直症测试中，利血平显著增加僵直症评分（p<0.05），各治疗组均显著降低僵直症反应（p<0.05），CSMNPs（50 mg•kg
?1）僵直症评分显著低于其他治疗组（p<0.05）。（7）体内抗氧化研究：SOD水平——利血平显著降低SOD含量（p<0.05），各治疗组显著逆转（p<0.05），CSMNPs（50 mg•kg
?1）SOD含量显著高于MP提取物、MSNPs（25和50 mg•kg
?1）和CSMNPs（25 mg•kg
?1）（p<0.05）；MDA水平——利血平显著增加MDA含量（p<0.05），各治疗组显著降低（p<0.05），CSMNPs（50 mg•kg
?1）MDA水平显著低于其他组（p<0.05）；CAT含量——利血平显著降低CAT含量（p<0.05），各治疗组显著逆转（p<0.05），CSMNPs（50 mg•kg
?1）CAT含量显著高于其他组（p<0.05）；GSH水平——利血平显著降低GSH水平（p<0.05），各治疗组显著逆转（p<0.05），CSMNPs（50 mg•kg
?1）GSH含量显著高于其他组（p<0.05）。（8）亚硝酸盐水平测定：利血平诱导的PD大鼠中亚硝酸盐浓度显著增加（p<0.05），各治疗组有效逆转利血平效应（p<0.05），CSMNPs（50 mg•kg
?1）亚硝酸盐含量显著低于MP提取物、MSNPs（25和50 mg•kg
?1）和CSMNPs（25 mg•kg
?1）（p<0.05）。（9）海马区组织病理学研究：组织病理学检查显示利血平诱导的PD大鼠海马齿状回（DG）和安蒙角（CA4）神经变性；对照组神经元细胞排列良好；利血平给药大鼠海马神经元显示严重固缩和坏死征象，提示广泛神经变性和神经元群体部分丢失；MP提取物、MSNPs（25和50 mg•kg
?1）和CSMNPs（25和50 mg•kg
?1）治疗组与利血平组相比显示出保护作用。（10）中脑黑质组织病理学研究：组织病理学结果显示PD大鼠模型黑质致密部多巴胺能神经元大量丢失和死亡，以及坏死和皱缩；对照组显示正常神经元组装（淡泡状核、显著核仁）和Nissl颗粒外周分布；利血平处理大鼠显示神经元显著丢失，伴有胞质内路易小体积累；MP提取物、MSNPs（25和50 mg•kg
?1）和CSMNPs（25和50 mg•kg
?1）治疗组与利血平组相比显示出保护效应。
讨论部分总结：Se NPs因其抗氧化特性而被研究用于PD治疗。硒是硒蛋白（如谷胱甘肽过氧化物酶）中的重要微量元素，可中和有害自由基和超氧自由基，减少氧化应激。本研究中MSNPs的改善活性可能与Se支持内源性抗氧化防御和减少氧化失衡的能力有关。CS是制药领域最广泛使用和安全的天然生物聚合物之一，是一种聚阳离子、无毒稳定剂，用于制备聚合物NPs。细胞膜的负表面可能吸引正表面电荷的颗粒。没有适当稳定剂时，裸金属NPs之间的范德华力会导致聚集。相反，由于显著的静电排斥，CS作为包裹金属的正电荷空间屏障，产生均匀的NP溶液。CS还可作为Se-NPs的良好稳定剂。由于CS的潜在抗氧化活性，CSMNPs的体外抗氧化特性显著增强。因此，CS的引入可能有助于改善本研究中观察到的Se基纳米制剂的稳定性和生物学性能。药物要发挥中枢神经系统效应，必须具有BBB通透性。纳米制剂是增加BBB通透性的广泛使用技术。由于其微小尺寸、增强的稳定性和增加的载药能力，它们可有效穿过BBB。本研究旨在评估MP和CS偶联的Se NPs的抗帕金森病活性。研究从微波辅助提取等绿色技术开始，对MP种子粉末水提物进行表征，随后合成和表征金属NPs（MSNPs），并合成和表征聚合物-金属纳米复合材料（CSMNPs）以稳定Se NPs。此外，研究还包括使用体外和体内模型的抗氧化测定以及抗帕金森病活性评估。在实验设计中，研究人员使用两种浓度的MSNPs和CSMNPs（25 mg•kg
?1和50 mg•kg
?1）以防止Se在NPs形式的神经毒性效应。本研究中通过微波辅助提取发现MP种子中L-DOPA含量为27.5%，而 earlier reports of 5–7% L-DOPA in MP seeds obtained by traditional extraction methods。因此，与L-DOPA（100 mg•kg
?1）相比，研究人员选择使用MP种子提取物剂量的一半，即50 mg•kg
?1。较低剂量的Se NPs和CS@Se NPs获得的结果与L-DOPA（100 mg•kg
?1）和MP提取物（50 mg•kg
?1）相当。所有研究均经统计学分析，证实MSNPs和CSMNPs具有显著的神经保护和抗氧化活性。为确认合成和表征MSNPs和CSMNPs，研究人员采用了多种分析方法，包括紫外-可见光谱、FTIR光谱、流体动力学直径、Zeta电位和HRTEM-SAED。FTIR研究旨在了解功能团在金属NPs还原和稳定中的相互作用。Zeta sizer确认了NPs的流体动力学直径，Zeta电位测定展示了金属NPs的稳定性。PDI值代表NPs的分散性和尺寸分布。CSMNPs的流体动力学直径增加可能是由于颗粒间缔合和聚集。HRTEM研究显示MSNPs和CSMNPs为球形。流体动力学直径和HRTEM尺寸之间的差异是由于测量原理不同。在流体动力学直径测量中，NPs的测量涉及水合聚合物层和分散体中NPs的聚集；而在HRTEM中，尺寸测量涉及TEM网格上干燥沉积的初级NPs的测量。XRD研究确认NPs和CSMNPs的结晶性质为无定形。研究人员采用DPPH和ABTS测定等自由基清除模型研究体外抗氧化特性。结果显示，MSNPs和CSMNPs将电子转移给DPPH•自由基（紫色）并将其转化为稳定的DPPH-H（黄色）。类似地，在MSNPs和CSMNPs存在下，ABTS•+（深绿色）被还原为ABTS（无色）。随着NPs浓度增加，自由基还原能力也增加。MP提取物、MSNPs和CSMNPs的IC50显著高于抗坏血酸。神经药理学分析通常评估药物对CNS的影响。研究人员评估握力测试和僵直症评分以评估神经行为活性。利血平给药显著降低大鼠握力，表明与帕金森病症状相关的神经肌肉协调受损。与利血平诱导的PD大鼠组相比，L-DOPA、MP提取物、MSNPs和CSMNPs治疗改善了握力。较高剂量MSNPs和CSMNPs观察到的相对更好的运动表现表明纳米制剂能够减轻利血平产生的运动障碍。在测试的制剂中，CSMNPs（50 mg•kg
?1）显示出最显著的改善，表明CS的引入可能增强了Se NP制剂的整体活性。僵直症评分降低预测抗帕金森病效应。本研究结果显示，利血平（0.2 mg•kg
?1）处理大鼠表现出显著（p<0.05）增加的僵直行为，表明严重运动障碍。与疾病对照组相比，L-DOPA、MP提取物、MSNPs和CSMNPs给药显著（p<0.05）降低僵直反应，而CSMNPs（50 mg•kg
?1）处理大鼠在所有治疗组中僵直症评分降低最显著。NPs的增强效应可能归因于改善的生物利用度、持续释放和增强的抗帕金森病活性。Cohen’s d分析进一步支持了结果的统计学显著性。此外，为确认MP提取物、MSNPs和CSMNPs的神经保护效应，研究人员使用体内模型进行抗氧化测定。在利血平诱导的PD大鼠模型中评估了SOD、GSH和过氧化氢酶等抗氧化剂水平。研究显示利血平给药后SOD含量逐渐降低。MP提取物、MSNPs和CSMNPs治疗后SOD恢复表明这些制剂可能有助于加强对利血平相关氧化应激的抗氧化防御。与其他动物组相比，CSMNPs（50 mg•kg
?1）给药产生更有益的效果。谷胱甘肽过氧化物酶作用于底物还原型谷胱甘肽（GSH），产生作为防御机制的自由基。然而，利血平诱导PD的大鼠大脑中GSH含量通常较低。MP提取物（50 mg•kg
?1，p.o.）、MSNPs（25和50 mg•kg
?1）和CSMNPs（25和50 mg•kg
?1，p.o.）显著（p<0.05）升高GSH水平。CSMNPs（50 mg•kg
?1，p.o.）取得比其他动物组更好的结果。在大鼠大脑中，NPs控制多种抗氧化剂的酶活性。过氧化氢酶是将H
2O
2转化为水和氧气的关键酶，据报道可解毒生成的SOD。利血平给药后过氧化氢酶含量降低，促进PD发展。本研究显示，MP提取物、MSNPs和CSMNPs治疗显著逆转了利血平诱导PD的效应，这是由于诱导的氧化应激；当前PD模型中NO水平显著降低。在脂质过氧化中，MDA水平升高，表明利血平处理动物大脑中丙二醛（MDA）过量产生。MDA水平越高，削弱SOD等酶抗氧化活性的可能性越大。研究表明MP提取物、MSNPs和CSMNPs逐渐降低MDA产生。因此，可以说CSMNPs（50 mg•kg
?1，p.o.）对氧化应激的保护作用强于MP提取物。利血平处理大鼠的亚硝酸盐水平显著（p<0.05）高于对照组。然而，在接受MP提取物、MSNPs和CSMNPs的治疗组中，该影响被显著逆转。在大鼠中，大脑亚硝酸盐含量降低表明亚硝化应激减少和抗帕金森病行为改善。大鼠大脑海马区和黑质部的组织病理学评估（n=3）显示利血平诱导的PD大鼠神经退行性改变，包括神经元丢失、坏死、固缩和多巴胺能神经元皱缩。在PD大鼠中还观察到路易小体样包涵体积累。本研究表明，L-DOPA、MP提取物、MPNPs和CSMNPs治疗减少了利血平诱导的PD大鼠的病理改变并保持了正常神经元架构。MSNPs和CSMNPs增强了MP水提物对利血平诱导PD的效力和功效。总之，本研究结果表明MSNPs和CSMNPs在利血平诱导的PD大鼠中具有有前景的抗帕金森病和神经保护潜力。行为学、生化和组织病理学发现共同表明，减弱氧化和亚硝化应激可能有助于观察到的保护效应。在测试的制剂中，CSMNPs在50 mg•kg
?1时表现出相对更大的整体功效。这种增强的反应可能与Se、M. pruriens生物活性成分和壳聚糖稳定特性的联合效应有关。尽管如此，仍需进一步研究以确定这些效应的确切分子机制并确认制剂中各成分的贡献。
研究结论翻译：本研究涉及MP种子提取物、MSNPs和CSMNPs的合成与表征。体外和体内研究均揭示了MP提取物（50 mg•kg
?1，p.o.）、MSNPs（25和50 mg•kg
?1，p.o.）和CSMNPs（25和50 mg•kg
?1，p.o.）对利血平（0.2 mg•kg
?1，i.p.）诱导的PD大鼠模型的抗帕金森病特性。本研究结果表明，通过改善运动功能、握力和脑匀浆中的抗氧化水平，显著减轻了利血平诱导PD的效应。CSMNPs（50 mg•kg
?1，i.p.）表现出比MP提取物和MSNPs更好的抗帕金森病和抗氧化效果，行为学、生化和组织病理学参数的改善证实了这一点。来自MP提取物的聚合物修饰金属纳米复合材料的增强功效和效力与粗MP种子提取物和单独金属NPs相比表现出显著的抗帕金森病效果。
