《Emerging Microbes & Infections》：Structure of MPXV DNA ligase complex reveals a virus-specific pocket for selective inhibition
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猴痘（Mpox）由猴痘病毒（MPXV）引起，仍是公共卫生关注的问题，尽管强有力的遗传学和生物化学证据支持痘病毒DNA连接酶在病毒DNA复制和修复中的关键作用，但其功能的结构基础尚不明确。研究人员报道了MPXV DNA连接酶（MpxvLig）与带切口DNA复合物
猴痘（Mpox）由猴痘病毒（MPXV）引起，仍是公共卫生关注的问题，尽管强有力的遗传学和生物化学证据支持痘病毒DNA连接酶在病毒DNA复制和修复中的关键作用，但其功能的结构基础尚不明确。研究人员报道了MPXV DNA连接酶（MpxvLig）与带切口DNA复合物的晶体结构，分辨率为2.04 ?。MpxvLig采用ATP依赖性DNA连接酶的经典三结构域架构，包括N端DNA结合结构域（DBD）、核苷酸转移酶结构域（NTD）和C端寡核苷酸结合折叠结构域（OBD），三者共同形成钳状构象包裹带切口DNA以进行催化。该结构捕获了MpxvLig处于腺苷酰化步骤对应的活性催化状态，其中Lys233形成共价连接酶-AMP中间体。与人类DNA连接酶III催化核心的比较结构和生物化学分析揭示了结构域排列和DNA结合方面的显著差异，这与MpxvLig在体外具有更强的DNA结合能力和更高的连接活性相一致。小角X射线散射（SAXS）进一步表明，无配体MpxvLig在溶液中采用延伸的手电筒样构象。值得注意的是，研究人员在DNA结合结构域内鉴定了一个病毒特异性小分子结合口袋。米托蒽醌（Mitoxantrone）直接结合该口袋，在微摩尔浓度下抑制MpxvLig活性，而对人连接酶影响极小。口袋定义残基的突变显著减弱这种抑制，支持靶向作用机制。总之，这些发现建立了痘病毒DNA连接的结构基础，并为合理开发靶向MpxvLig的选择性抗病毒抑制剂提供了框架。
研究背景：猴痘（Mpox）由猴痘病毒（MPXV）引起，自2022年起在全球多国暴发，世界卫生组织（WHO）于2022年7月和2024年8月两次宣布其为国际关注的突发公共卫生事件。MPXV是一种大型双链DNA病毒，目前尚无病毒特异性治疗药物获批，仅推荐使用天花抗病毒药物特考韦瑞（tecovirimat）和布林西多福韦（brincidofovir）治疗MPXV感染。与大多数DNA病毒不同，痘病毒编码包括DNA聚合酶、DNA连接酶、拓扑异构酶和核酸酶在内的广泛DNA代谢酶库，支持病毒在宿主细胞内相对自主的DNA复制和修复。MPXV通过A50开放阅读框编码ATP依赖性DNA连接酶，该酶与痘苗病毒A50R蛋白高度同源。痘苗病毒遗传学研究显示，连接酶基因缺失虽不废除病毒在细胞培养中的复制，但突变病毒对紫外线（UV）和博来霉素等DNA损伤剂更敏感，且体内毒力减弱，凸显了痘病毒DNA连接酶的生物学重要性。然而，尽管有这些功能认识，此前尚无痘病毒DNA连接酶的实验结构报道。因此，研究人员开展了MpxvLig的结构与功能研究，旨在阐明痘病毒DNA连接的分子机制并探索选择性抗病毒抑制策略。
主要技术方法：研究人员在大肠杆菌（E. coli）中重组表达并纯化了MpxvLig及人DNA连接酶III催化核心（HsLigIII256-833），通过 sitting-drop 蒸气扩散法筛选并获得MpxvLig与22 bp带切口DNA、AMP和Mg2+的复合物晶体，在上海同步辐射光源收集X射线衍射数据（分辨率2.04 ?），以AlphaFold3预测结构为搜索模型通过分子置换法解析结构，使用Coot和Phenix进行迭代模型构建与精修。采用小角X射线散射（SAXS）分析无配体MpxvLig的溶液构象。通过体外DNA连接实验（变性尿素-PAGE）和电泳迁移率变动分析（EMSA）表征酶活性和DNA结合能力，采用表面等离子体共振（SPR）测定米托蒽醌与MpxvLig的直接结合。通过定点突变结合生化实验验证关键残基功能。
研究结果：
MpxvLig-DNA复合物的整体结构：研究人员解析了MpxvLig与带切口DNA复合物的晶体结构（空间群P212121，分辨率2.04 ?，Rwork=19.2%，Rfree=24.4%）。MpxvLig由554个氨基酸组成，分为N端DNA结合结构域（DBD）、核苷酸转移酶结构域（NTD）和寡核苷酸结合折叠结构域（OBD），围绕带切口DNA形成钳状架构。三个结构域形成中央通道供DNA底物穿过，静电表面分析显示该通道呈强碱性，被命名为中央碱性通道（CAC），可能促进底物捕获和稳定。
MpxvLig的催化核心：NTD构成催化核心，包含motif I（Met209-Gly236和Glu356-Ser409）和motif II（Glu237-Ser355），形成催化裂隙，AMP结合口袋位于两motif之间的沟槽深处。活性位点含ATP依赖性DNA连接酶特征性保守KXDG motif。电子密度清晰显示共价Lys233-AMP中间体，表明捕获的复合物代表连接酶的腺苷酰化状态。Lys399和Lys401与AMP磷酸基团相互作用，Lys384接触腺嘌呤环，Glu231与腺嘌呤氨基形成静电相互作用，腺嘌呤碱基与Phe319形成π–π堆积。活性位点观察到清晰的Mg2+密度，由切口处C11核苷酸O3′原子、AMP磷酸基团和四个水分子配位。保守谷氨酸Glu285位于motif I中靠近切口3′-OH，Glu379位于motif II中靠近AMP磷酸基团，二者对催化至关重要。突变分析显示K233A几乎完全废除连接酶活性，E379A仅保留约1.7%野生型活性，E285A、K399A和K401A分别保留15.5%、4.2%和12.7%活性。
MpxvLig的DNA识别模式：22 bp带切口DNA底物占据中央碱性通道，被多个碱性和极性残基接触。DBD中的Tyr20、Lys159和Tyr164插入DNA小沟直接参与底物结合。突变分析显示Y404A活性降低约50%，H518A活性降低约75%且严重影响蛋白纯化（提示结构稳定性受损），H518F恢复约75%野生型活性。双突变S252A/N254A活性降低约20%，支持这些残基对底物结合的集体贡献。
MpxvLig的生化表征：体外连接实验显示MpxvLig对22 bp底物的连接效率有限，对31 bp和40 bp底物的终点产率分别为73.2%和81.5%，高于22 bp底物的61.0%。时间进程实验拟合速率常数相似（k22 bp=0.125±0.014 min-1，k31 bp=0.091±0.017 min-1，k40 bp=0.099±0.016 min-1），表明底物长度主要影响连接产率而非表观反应速率。EMSA显示MpxvLig对40 bp底物结合最强，对22 bp底物结合最弱，表明对较长DNA底物的增强结合可能 underlying 其改善的连接产率。
MpxvLig与其他连接酶的结构同源性：与三种人DNA连接酶（HsLigI、HsLigIII和HsLigⅣ）相比，病毒DNA连接酶结构更紧凑，通常仅含最小催化核心。序列比较显示MpxvLig保留保守催化233-KXDG-236 motif及其他关键活性位点残基。结构叠加显示MpxvLig与HsLigIII256-833催化核心最相似（RMSD=0.757 ?），与AsfvLig、HsLigI和HsLigⅣ的RMSD分别为5.232 ?、1.541 ?和1.489 ?。MpxvLig与人类连接酶的差异集中于DNA结合通道和外周环。在HsLigIII结构中对应Arg441距切口5′-磷酸2.3 ?，HsLigI中对应Arg589距5′-磷酸3.3 ?，MpxvLig结构中Arg253占据切口附近类似位置，提示其可能参与后续催化步骤中5′-磷酸的识别或定位。
MpxvLig与HsLigIII的结构与催化活性比较：使用40 bp带切口DNA底物比较，MpxvLig在20 min内产生>50%连接产物，而HsLigIII256-833即使在60 min后仍低于50%。动力学拟合确认MpxvLig速率常数（0.108±0.019 min-1）显著高于HsLigIII256-833（0.013±0.006 min-1）。MpxvLig的DNA结合通道具有更有利的静电环境和更紧凑的OBD直接参与DNA结合，而HsLigIII256-833相应区域更开放且DNA结合残基较少。EMSA证实MpxvLig对40 bp带切口DNA底物的结合显著强于HsLigIII256-833，表明底物结合差异贡献了MpxvLig的更高活性。
MpxvLig的溶液构象与催化循环模型：SAXS实验显示无配体MpxvLig的Guinier区线性良好，表明单体分散且无聚集。配对距离分布函数呈单峰，最大维度约180 ?，最可能分子内距离约40-50 ?。ab initio重建显示三个结构域呈延伸手电筒样排列，AlphaFold3预测模型良好契合SAXS包络。研究人员提出MpxvLig从延伸手电筒样构象循环至闭合DNA结合钳状状态，依次完成腺苷酰化、DNA结合、AMP转移、磷酸二酯键形成和产物释放。
MpxvLig DBD中的病毒特异性小分子口袋：体外连接实验显示米托蒽醌剂量依赖性抑制MpxvLig，IC50为15.05 μM。SPR证实米托蒽醌与MpxvLig直接结合，解离常数7.74 μM。米托蒽醌对MpxvLig的抑制显著强于HsLigIII256-833。结构建模预测米托蒽醌结合MpxvLig DBD中独特的N端口袋（尺寸约13.49 ?×9.53 ?×8.66 ?），主要由Cys12、Tyr15、Tyr85和Met150构成。HsLigIII256-833对应区域中Met150被Arg327替代使口袋变窄，Tyr15和Tyr85被Asp188和Asp262替代，消除潜在π–π相互作用并增加口袋极性。序列比对显示这些口袋形成残基在人DNA连接酶中不保守。突变Y15A、M150R和Y15A/M150R不损害连接酶活性，但分别降低米托蒽醌敏感性12.1%、19.8%和32.8%。
讨论部分总结：DNA连接酶广泛分布于细胞生物中，但许多病毒不编码自身连接酶。已知最小的ATP依赖性DNA连接酶（如噬菌体T7和小球藻病毒）仅含NTD和OBD，类似最小催化核心；近期报道的ASFV连接酶含保守NTase结构域和OBD以及高度分化的N端DNA结合区。本研究显示MPXV连接酶采用更经典的三结构域架构，围绕带切口DNA底物形成完整催化核心。MpxvLig-带切口DNA复合物捕获了酶处于催化 competent 状态，表明痘病毒DNA连接酶遵循ATP依赖性连接酶的保守化学机制。Lys233形成共价连接酶-AMP中间体，活性位点谷氨酸Glu285和Glu379 positioned 以促进后续转移和链封闭步骤。这些观察建立了痘病毒DNA连接的首个直接结构框架。未能获得MpxvLig与5′-磷酸化DNA的合适晶体，可能与磷酸诱导的切口位点局部相互作用或构象动态变化有关，或与人DNA连接酶在蛋白-DNA界面和晶体堆积方面的差异有关，但这些解释尚未经实验验证。尽管MpxvLig与HsLigIII催化核心高度结构相似，但其连接活性和DNA结合显著更强，数据表明这种差异主要源于DNA结合通道的架构和静电性质。MpxvLig似乎优化用于高效结合带切口DNA底物，与其在病毒基因组加工和修复中的作用一致。痘病毒DNA连接酶在培养细胞中对病毒复制非必需，但痘苗病毒遗传学研究显示连接酶缺失使病毒对DNA损伤剂敏感并减弱体内毒力，提示痘病毒连接酶在感染期间应激条件下维持基因组完整性方面可能特别重要。结构指导鉴定此前未探索的蛋白口袋已被强调为扩展药物发现机会的有前景策略。MpxvLig DBD中病毒特异性小分子口袋的鉴定尤为重要。米托蒽醌结合MpxvLig DBD中由Tyr15和Met150等残基形成的病毒特异性口袋，对MpxvLig的抑制（IC50=15.85±1.63 μM）强于HsLigI（IC50=30.75±0.90 μM）和HsLigIII（IC50=28.71±2.76 μM），突变支持其在抑制剂敏感性中的作用而不影响催化。口袋形成残基Tyr15和Met150在正痘病毒DNA连接酶中保守但在其他痘病毒连接酶中分化，凸显该位点作为正痘病毒导向抑制剂开发的潜在靶点。米托蒽醌的抗病毒活性已在多个正痘病毒模型中研究，不同实验系统疗效不一。早期工作显示米托蒽醌抑制BSC-40细胞中痘苗病毒复制，但未能保护BALB/c小鼠免受致死性痘苗病毒感染；后续研究报道米托蒽醌抑制BSC-1细胞中MPXV和CPXV复制并对BALB/c小鼠CPXV感染提供部分保护。这些发现建立了抗病毒活性的先例，同时凸显米托蒽醌作为治疗化合物的局限性。因此，尽管其细胞毒性和对人DNA连接酶的活性限制其直接治疗潜力，MpxvLig中结构定义口袋的鉴定为结构指导优化更具选择性和更低细胞毒性的抑制剂提供了有用框架。
研究结论翻译：总之，本研究提供了痘病毒DNA连接酶与带切口DNA结合的结构视图，定义了该酶的保守催化逻辑，解释了其相对于人同源物增强的DNA结合和连接效率，并鉴定了一个可用于选择性化学抑制的病毒特异性口袋。这些发现为理解痘病毒DNA连接和结构指导抗病毒药物开发奠定了基础。
