《Virulence》：HSC71 acetylation confers protection against Spiroplasma eriocheiris infection by inhibiting apoptosis and promoting ROS production in arthropods
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热休克同源蛋白71 kDa（HSC71）属于热休克蛋白70（HSP70）家族，是宿主先天免疫不可或缺的组分，其功能受翻译后修饰精细调控。然而，HSP70翻译后修饰在病原感染过程中调控免疫功能的作用尚不清楚。本研究探讨了HSC71乙酰化修饰介导蟹类抵抗胞内病原菌
热休克同源蛋白71 kDa（HSC71）属于热休克蛋白70（HSP70）家族，是宿主先天免疫不可或缺的组分，其功能受翻译后修饰精细调控。然而，HSP70翻译后修饰在病原感染过程中调控免疫功能的作用尚不清楚。本研究探讨了HSC71乙酰化修饰介导蟹类抵抗胞内病原菌Spiroplasma eriocheiris感染的机制。机制上，肉碱O-乙酰转移酶（Crat）在赖氨酸579位点（K579）乙酰化HSC71，通过促进E3泛素连接酶CHIP的解离而阻止其泛素化，从而提高HSC71稳定性。在HSC71缺陷或Crat缺陷的蟹中，血细胞凋亡显著增强，导致宿主在S. eriocheiris攻击后死亡率升高。同时，HSC71的K579乙酰化削弱了HSC71与超氧化物歧化酶（SOD）的相互作用，导致细胞内活性氧（ROS）积累，从而限制S. eriocheiris的增殖。用EX-527对去乙酰化酶SIRT1进行药理学抑制可增强HSC71乙酰化、提高ROS产生并降低蟹对S. eriocheiris感染的易感性。值得注意的是，EX-527同样增强了黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）HSC71同源物HSPA8的乙酰化，进而损害其与SOD的相互作用，导致ROS水平升高并限制果蝇S2细胞中S. eriocheiris的胞内增殖。因此，本研究确立了调控HSC71乙酰化作为对抗S. eriocheiris感染的一条有前景的途径。
研究背景：HSP70家族是宿主先天免疫的重要组成部分，其功能受翻译后修饰的精细调控，但HSP70翻译后修饰在病原感染中如何调控免疫功能仍认识有限。已有研究表明，HSP70的甲基化、磷酸化、乙酰化等修饰可通过不同机制影响其功能，赖氨酸残基的乙酰化与泛素化常相互竞争，乙酰化往往拮抗泛素—蛋白酶体介导的降解。然而，无脊椎动物中修饰HSP70的具体乙酰转移酶或去乙酰化酶及其乙酰化的功能影响尚不清楚。ROS作为抗菌效应分子参与宿主免疫，而研究人员此前发现S. eriocheiris感染果蝇S2细胞后胞内ROS水平显著升高并呈动态变化，且由于S. eriocheiris的毒力因子和结构组分不同于典型细菌或病毒，经典抗菌肽或免疫通路对其清除基本无效，这促使研究人员探究ROS稳态的动态调控是否影响S. eriocheiris的致病性或宿主免疫。基于此，本研究以蟹类为对象，从乙酰化修饰角度解析HSC71介导抗S. eriocheiris感染的机制。
研究结论与意义：本研究发现Crat在K579位点乙酰化HSC71，阻止CHIP介导的泛素化与降解，从而稳定HSC71并增强宿主对S. eriocheiris感染的抵抗力；同时，SIRT1抑制剂EX-527增强HSC71乙酰化，促进其与SOD解离、升高胞内ROS水平，在蟹和果蝇S2细胞中均产生抗S. eriocheiris的保护作用。研究将Crat介导的HSC71乙酰化鉴定为协调先天免疫应答的新型调控机制，为对抗S. eriocheiris感染提供了潜在途径。
关键技术方法（不超过250字）：研究人员以中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis，约25 g，取自江苏宝应某养殖场，实验前暂养1周）为体内模型，以果蝇S2细胞为体外模型，采用乙酰化组学（acetylome）分析筛选差异乙酰化蛋白；通过免疫共沉淀（Co-IP）与免疫印迹（immunoblotting）检测乙酰化、泛素化及蛋白相互作用；采用质谱（MS）鉴定HSC71互作蛋白；利用RNA干扰（siRNA/dsRNA）进行基因敲低；通过流式细胞术检测凋亡、线粒体膜电位与胞内ROS；采用绝对定量PCR测定病原载量，并以Kaplan–Meier法进行生存分析。
研究结果：
保护作用：HSC71对蟹抗S. eriocheiris感染具有保护作用。乙酰化组学显示感染后HSC71乙酰化显著降低（0.137倍变化），IP证实感染降低血细胞中HSC71乙酰化；HSC71转录水平在感染早期下调、后期上调。siRNA沉默HSC71后血细胞凋亡增加、线粒体膜电位丧失，蟹体内S. eriocheiris载量升高、存活率下降，表明HSC71为蟹抵抗该菌感染所必需。
K579位点乙酰化：HSC71赖氨酸579位点乙酰化可抑制凋亡从而保护果蝇S2细胞。基于乙酰化组学数据鉴定K579为潜在乙酰化位点，该位点在甲壳类中严格保守；K579Q（模拟高乙酰化）与K579R（模拟低乙酰化）突变体分析显示，感染导致的HSC71乙酰化下降可被K579Q阻断；K579Q显著抑制感染诱导的细胞凋亡、提高细胞活力并大幅降低S. eriocheiris载量。
互作蛋白鉴定：通过抗HSPA8抗体IP结合质谱鉴定出25个与HSC71特异共沉淀的候选蛋白，其中Crat作为乙酰转移酶备受关注；Co-IP证实HSC71与Crat互作，Crat过表达显著增强HSC71乙酰化；同时证实HSC71与SOD、过氧化物还原酶（Prx）互作，激光共聚焦显示HSC71与Crat、SOD、Prx在胞质中共定位。
Crat乙酰化稳定HSC71：感染导致血细胞中Crat下调，与HSC71乙酰化下降一致；siRNA敲低Crat后HSC71乙酰化与蛋白水平降低而mRNA不变，HSC71泛素化增加；Crat缺陷加剧血细胞凋亡与线粒体膜电位崩溃，蟹体内S. eriocheiris载量升高、存活率下降。在S2细胞中，Crat促进HSC71乙酰化与稳定，该作用被K579R突变消除；Crat过表达降低HSC71泛素化；HSC71与CHIP及其果蝇同源物DmCHIP直接互作，Crat存在时该互作明显减弱，并大幅消除CHIP/DmCHIP介导的HSC71泛素化；K579Q减弱HSC71与CHIP/DmCHIP结合并降低其泛素化；CHIP/DmCHIP剂量依赖性降低HSC71蛋白水平，而Crat过表达可逆转之，表明Crat通过竞争性结合拮抗CHIP介导的HSC71泛素化与降解。
ROS介导的抗菌防御：感染后过表达K579Q的S2细胞ROS产生显著增加；K579Q显著减弱HSC71与SOD及DmSOD的结合，K579R则增强结合，而HSC71与Prx的结合不受乙酰化影响；K579Q组SOD活性显著降低、K579R组升高。Crat缺陷蟹血细胞ROS降低、SOD活性升高；Crat过表达明显破坏HSC71与SOD结合。感染显著诱导血细胞SOD转录；dsRNA敲低SOD提高血细胞ROS水平、降低S. eriocheiris载量并提高感染蟹存活率，证明ROS系统在抗该菌防御中的关键作用。
EX-527的应用：广谱SIRT抑制剂NAM而非HDAC抑制剂TSA显著提高HSC71乙酰化，选择性抑制剂实验表明SIRT1抑制剂EX-527而非SIRT2抑制剂SirReal2在6 h内显著增强蟹血细胞HSC71乙酰化，提示SIRT1为主要去乙酰化酶；EX-527提高胞内ROS、抑制SOD活性并减弱SOD与HSC71互作；EX-527预处理显著降低蟹血细胞S. eriocheiris载量并延长感染蟹存活时间。S2细胞中SIRT1过表达降低HSC71乙酰化且可被EX-527逆转；序列比对确认催化组氨酸在物种间保守，H343Y催化失活突变体不能降低外源HSC71及内源同源物HSPA8的乙酰化，表明SIRT1为HSC71的特异去乙酰化酶且依赖其催化活性。EX-527提高S2细胞内源HSPA8乙酰化、升高ROS与SOD活性；过表达EsSOD或DmSOD降低胞内ROS，EX-527可部分恢复被DmSOD过表达抑制的ROS水平；EX-527破坏内源HSPA8与DmSOD互作；DmSOD过表达降低感染后S2细胞活力并增加S. eriocheiris载量，EX-527可部分挽救细胞死亡并抑制病原增殖。综上，EX-527通过促进HSC71乙酰化与ROS产生，在蟹和果蝇S2细胞中均表现出保守的抗S. eriocheiris保护作用。
讨论与结论总结：HSP70家族在宿主—病原互作中通过调控病毒进入、胞内转运、复制及激活先天免疫发挥作用。本研究中HSC71对S. eriocheiris感染显著响应，转录水平先降后升而乙酰化水平下降，敲低HSC71降低蟹存活并促进病原增殖；HSC71缺陷触发血细胞凋亡，与其保守的抗凋亡功能一致。乙酰化作为常见翻译后修饰可调控酶活性、稳定性、亚细胞定位与相互作用；既往研究显示HSP70不同位点乙酰化对自噬、凋亡影响各异，本研究则揭示K579乙酰化通过稳定HSC71及削弱HSC71–SOD互作促进ROS积累以限制病原。研究结论为：本研究确立了HSC71乙酰化调控作为对抗S. eriocheiris感染的一条有前景的途径。
