三碘甲状腺原氨酸（T3）对小鼠白色、棕色和米色脂肪细胞产热与代谢程序的分化调控

《Adipocyte》：Triiodothyronine (T3) differentially regulates thermogenic and metabolic programs in murine white, brown, and beige adipocytes

　　

甲状腺激素在能量代谢和产热中发挥核心作用，但三碘甲状腺原氨酸（T3）在不同脂肪细胞谱系中由脂肪细胞内在机制介导的应答仍未完全明确。本研究在确定的体外条件下，比较了分化的小鼠白色（3T3-F442A）、棕色（EB5）和米色（EB7）脂肪细胞在持续T3暴露下的转录和功能应答。T3增加了棕色和米色脂肪细胞中Thrb和Dio2的表达，但未增加白色脂肪细胞中的表达。T3还产生了谱系特异性的基因调控模式。产热基因Ppargc1a和Ucp1在棕色和米色脂肪细胞中被强烈诱导，而白色脂肪细胞反应极小。参与脂质和碳水化合物代谢的基因也受到差异性调控：棕色和米色脂肪细胞表现出与产热代谢支持相一致的模式，而白色脂肪细胞则表现出独特的、产热取向较弱的应答。功能分析显示，经T3处理的脂肪细胞保留了β-肾上腺素能脂解能力，将转录应答与代谢功能联系起来。这些发现表明，持续T3暴露引发脂肪细胞内在的、谱系依赖性的应答，并提示甲状腺激素有利于棕色和米色脂肪细胞中支持能量消耗的代谢程序，而在白色脂肪细胞中发挥更符合能量储存而非产热激活的独特效应。

研究背景方面，白色、棕色和米色/浅棕色（brite/beige）脂肪细胞具有不同的生理作用和显著不同的代谢特征。白色脂肪细胞主要以甘油三酯形式储存多余能量，而棕色和米色脂肪细胞通过产热耗散能量，该过程由解偶联蛋白1（UCP1）介导的线粒体呼吸驱动。白色脂肪组织（WAT）功能障碍促进肥胖和2型糖尿病的发生，而棕色脂肪组织（BAT）和米色脂肪组织（BRT）活性增加支持葡萄糖和脂质稳态并预防代谢性疾病。人体正电子发射断层扫描（PET）研究显示，与瘦者相比，肥胖和胰岛素抵抗受试者的BAT葡萄糖摄取降低，提示棕色脂肪活性受损可能促进代谢功能障碍。棕色脂肪细胞主要存在于解剖学定义的脂肪库中，如肩胛间区域，而米色脂肪细胞分散于白色脂肪库内，在适当生理刺激下可获得产热特性。WAT中出现米色脂肪细胞的现象称为"褐变"，反映了脂肪组织的可塑性。甲状腺激素（TH）是能量平衡的主要调节因子，对脂肪组织代谢具有广泛影响。具有生物活性的三碘甲状腺原氨酸（T3）通过核甲状腺激素受体（TRα和TRβ）调节基因表达，这些受体作为配体依赖性转录因子结合靶基因中的甲状腺激素应答元件（TREs）。在脂肪组织中，TRβ在BAT中占优势，而TRα在WAT中表达更高，提示TH具有脂肪库特异性作用。临床上，甲状腺状态对体重和代谢有强烈影响：甲状腺功能减退与产热减少和体重增加相关，而甲状腺功能亢进则增加基础代谢率、脂解和脂肪丢失。遗传学和药理学研究表明，T3促进白色脂肪细胞中的脂质周转并激活棕色和米色脂肪细胞中的产热程序，诱导UCP1表达、线粒体生物发生和氧化代谢。此外，TH通过调节葡萄糖转运蛋白表达和胰岛素敏感性影响脂肪组织中的葡萄糖摄取和利用。然而，涉及下丘脑调节的中枢机制虽已明确，但T3对白色脂肪细胞以及棕色和米色脂肪细胞的直接、细胞自主效应，特别是在缺乏交感神经输入的情况下，仍知之甚少。该领域进展有限的部分原因在于缺乏可靠的棕色和米色脂肪细胞体外模型。与BAT不同，米色脂肪细胞不形成离散的脂肪库，而是分散于WAT中，使其分离和研究具有挑战性。为填补这一空白，研究人员近期从11-12天小鼠胚胎中衍生了两个非病毒永生化克隆前脂肪细胞系EB5和EB7。分化后，EB5细胞获得棕色脂肪细胞表型，而EB7细胞分化为米色样脂肪细胞，两者均表达编码关键碳水化合物和脂质代谢酶的基因以及UCP1，具有产热能力。这些细胞系为在受控条件下检查支配棕色和米色脂肪细胞代谢的脂肪库特异性调控机制提供了可操作平台，特别适合研究TH的直接细胞自主作用。本研究中，研究人员使用EB5和EB7脂肪细胞以及3T3-F442A白色脂肪细胞，系统检查T3对脂肪细胞代谢的直接效应，重点关注调节脂肪酸摄取和细胞内脂解、葡萄糖代谢、脂肪生成、脂肪酸转运、单不饱和脂肪酸合成、产热和脂肪因子产生的基因。这一比较使研究人员能够识别对T3的脂肪库特异性转录和功能应答，为甲状腺激素如何差异性调节储能和产热脂肪细胞提供见解。本研究以白色、棕色和米色脂肪细胞模型的并列比较为特色，允许在相同培养条件下区分谱系特异性T3应答，具有重要意义。

在关键技术方法方面，研究使用3T3-F442A白色前脂肪细胞、EB5棕色前脂肪细胞和EB7米色前脂肪细胞（来源于11-12天小鼠胚胎的非病毒永生化克隆细胞系），在确定条件下诱导分化，并在分化后给予10 nM T3处理144小时。采用实时定量PCR（qPCR）分析基因表达，以Rplp0为内参基因（经RefFinder评估稳定性），通过2^-ΔCt方法计算相对表达量。采用甘油释放实验评估脂解功能，以去甲肾上腺素（5 μM，7小时）刺激后测定培养基中可溶性甘油含量，并以细胞蛋白量归一化。数据分析采用单因素或双因素方差分析（ANOVA），以p≤0.05为差异有统计学意义。

研究结果方面，3.1 脂肪细胞分化和T3依赖性甲状腺激素信号成分调控：研究人员首先确认三种脂肪细胞模型均分化为成熟脂肪细胞（油红O染色显示细胞内脂质积累），T3未显著改变脂质积累。EB5和EB7前脂肪细胞表达低水平Thrb，分化为脂肪细胞后Thrb表达显著增加，T3处理进一步诱导（两细胞系均约1.4倍）；而F442A白色前脂肪细胞和脂肪细胞均不表达Thrb。Dio2在EB5和EB7前脂肪细胞中可检测到，分化后显著增加，EB5脂肪细胞中Dio2水平约为EB7的11倍；T3进一步刺激Dio2表达，EB5脂肪细胞中增加约4倍，EB7脂肪细胞中增加约40倍；而F442A中Dio2表达始终较低且不被T3诱导。因此，Thrb和Dio2对分化和T3的协调表达局限于棕色和米色脂肪细胞。

3.2 T3刺激棕色和米色脂肪细胞中脂肪生成和产热基因表达：T3使EB5和EB7脂肪细胞中Pparg表达增加3倍以上，但使F442A脂肪细胞中Pparg表达降低约30%。Prdm16在EB5和EB7前脂肪细胞和脂肪细胞中表达相当，T3使EB5脂肪细胞中Prdm16表达增加约1.7倍，但未影响EB7；F442A脂肪细胞中Prdm16表达相对较低。T3强烈诱导两种产热脂肪细胞中产热调节因子Ppargc1a和Ucp1的表达：EB5脂肪细胞中Ppargc1a增加约11倍，EB7中约4倍；Ucp1分别增加约4倍和约2倍。相反，T3未诱导F442A脂肪细胞中Ppargc1a或Ucp1表达。

3.3 β-肾上腺素能刺激和细胞内脂解的生理应答：T3单独未显著改变两种脂肪细胞的基础脂解活性，表明T3在这些条件下不直接驱动急性脂解。去甲肾上腺素诱导强烈的脂解应答，且不依赖于T3，EB7脂肪细胞中甘油释放增加约7倍，EB5中约12倍。两种克隆的基础脂解相当。然而，与EB5脂肪细胞不同，EB7脂肪细胞在T3存在下未显示对去甲肾上腺素的增强应答。T3对EB5和EB7脂肪细胞中Pnpla2（ATGL）和Lipe（HSL）转录水平仅产生轻微或无显著变化。在T3处理的脂肪细胞中，去甲肾上腺素倾向于下调Pnpla2和Lipe。去甲肾上腺素不依赖于T3增加EB5和EB7脂肪细胞中Ucp1 mRNA表达；T3和去甲肾上腺素联合处理进一步增强Ucp1水平，相对于未暴露于T3的去甲肾上腺素刺激细胞，EB5脂肪细胞中额外增加约4.4倍，EB7中约2.7倍。

3.4 葡萄糖转运和脂质代谢相关基因：T3使EB5脂肪细胞中Fasn表达增加约9倍，EB7中约2倍，对F442A无显著影响。Mlxipl在EB5中增加约4倍，EB7中约2倍，而在F442A中降低约40%。T3使EB5和EB7脂肪细胞中Gpd1表达增加约1.5倍，但使F442A中降低约70%。类似地，Slc2a4（GLUT4）在EB5中强烈诱导（约9倍），EB7中约2倍，而在F442A中下调约80%。

3.5 脂肪酸摄取、细胞内脂肪酸转运和线粒体输入：T3使EB5棕色脂肪细胞中Lpl mRNA表达增加约4倍，EB7米色脂肪细胞中约2倍，而对3T3-F442A白色脂肪细胞无显著影响。T3使EB5和EB7脂肪细胞中Fabp4表达增加约2倍，但使F442A中降低约60%。Cd36表达在EB5脂肪细胞中被T3显著诱导（约15倍），EB7中适度诱导（约2倍），对F442A无影响。F442A脂肪细胞中基线Cpt1b表达较低，T3处理后进一步降低约60%；相反，EB5和EB7脂肪细胞中Cpt1b表达增加，T3使两种产热脂肪细胞中均增加约2倍。T3还使所有三种脂肪细胞中Acacb表达下调约80%。

3.6 单不饱和脂肪酸合成：T3差异性调节各脂肪细胞类型中Scd1表达。Scd1表达在EB7脂肪细胞中增加约2倍，而在EB5和F442A脂肪细胞中降低约50%。

3.7 脂肪因子表达：T3显著降低所有三种脂肪细胞中Lep表达，降幅约60%至85%。Adipoq表达在F442A脂肪细胞中降低约80%，EB5中约50%，而EB7中无显著变化。

讨论部分总结如下：本研究旨在评估分化脂肪细胞对持续T3暴露的转录应答，而非急性早期应答基因激活的动力学。核心发现是T3在多种脂肪细胞类型中引发独特的、谱系特异性的转录程序，将棕色和米色脂肪细胞中的产热激活与脂质和碳水化合物代谢的差异性调控联系起来。这些发现应在确定的体外系统背景下考虑，其中脂肪细胞与体内塑造产热调节的系统和神经元输入相隔离。10 nM T3广泛用于体外研究以引发清晰的转录应答，但高于循环生理水平，因此应解释为持续刺激条件。EB5和EB7模型的先前表征显示，选定的激素诱导转录应答伴随相应的蛋白质水平和功能变化；去甲肾上腺素增加UCP1蛋白含量，且这些脂肪细胞中已证实β-肾上腺素能脂解能力。这些先前的验证支持将基因表达分析解释为本研究中产热和代谢程序编制的信息性读数，而当前工作通过甘油释放实验增加了功能评估。4.1 Thrb和Dio2在产热脂肪细胞中的协调调控：棕色（EB5）和米色（EB7）脂肪细胞对T3应答表现为Thrb和Dio2的协调诱导，而F442A白色脂肪细胞中未观察到该模式。所用Thrb引物扩增TRβ1和TRβ2转录本共有序列，因此EB5和EB7脂肪细胞中Thrb表达增加不能归因于任一亚型。TRβ1已在培养的棕色脂肪细胞中检测到并与T3应答性产热基因调控相关。TRβ信号以脂肪库依赖方式调节脂肪组织中Zfp423，尽管该研究未区分两种TRβ亚型。因此TRβ1可能是此处观察到的应答的贡献者，但无法从本实验确定其贡献。TRα1也可能贡献T3应答性：在T3应答性3T3-L1脂肪细胞（与3T3-F442A相关的3T3衍生脂肪细胞系）中已有 predominant Thra1表达伴随很少或没有Thrb1的报道。这种谱系特异性应答与产热脂肪细胞中增强的甲状腺激素信号传导能力一致，可能涉及受体可用性增加和局部T4向T3转化。虽然甲状腺激素受体表达的T3自身调节最初在非洲爪蟾变态发育中描述，但研究人员的发现表明类似的调控关系可能在哺乳动物脂肪细胞中运作，特别是在产热谱系中。T3显著增加EB5和EB7脂肪细胞中Dio2表达，支持先前关于Dio2可受甲状腺激素本身调节的发现，此外还受交感神经输入调节。这种调节可能有助于在持续刺激下维持细胞内T3可用性。值得注意的是，EB5脂肪细胞表现出更大的Dio2诱导，而EB7脂肪细胞表达更高的Thrb，提示经典棕色和米色脂肪细胞之间TH应答性的定量差异。这些观察进一步表明Thrb和Dio2在这些条件下在米色脂肪细胞中表达，支持它们在甲状腺激素应答性基因调控中的潜在作用。4.2 脂肪细胞模型选择和谱系特异性产热应答性：3T3-F442A前脂肪细胞保留在体内形成白色脂肪组织的能力，支持其作为稳定白色脂肪细胞模型的用途。相反，3T3-L1细胞在特定体外条件下表现出更大的可塑性，包括对罗格列酮、IBMX和甲状腺激素等褐变刺激的应答性；然而它们不在体内形成脂肪细胞。在本研究使用的条件下，3T3-F442A前脂肪细胞有效分化为充满脂质的脂肪细胞，同时保持白色脂肪细胞特征，因为尽管暴露于罗格列酮和T3，它们未激活产热基因程序。EB5和EB7模型提供了棕色和米色脂肪细胞谱系的互补代表，各自表现出独特的产热和代谢基因调控模式。研究人员的发现与小鼠中报道的若干应答一致：T3在BAT中诱导Ucp1、Ppargc1a和Cpt1b，与EB5和EB7脂肪细胞中的诱导一致。局部甲状腺激素信号传导是适应性BAT产热所必需的，而脂肪细胞TRβ调节iWAT中葡萄糖、脂肪生成和产热途径，与EB7细胞中Slc2a4、Mlxipl、Fasn和Ucp1增加一致。4.3 T3直接激活产热转录程序：PGC1α和UCP1是线粒体生物发生和解偶联呼吸的核心效应物。T3强烈诱导EB5和EB7脂肪细胞中Ppargc1a和Ucp1表达，而白色脂肪细胞中未观察到诱导。机制上，Ucp1包含功能性甲状腺激素应答TRE元件，其启动子整合来自TR/RXR异二聚体、PPARs、视黄醇受体和C/EBP家族成员的输入。PGC1α通过其作为连接甲状腺激素信号与氧化代谢的转录共激活因子的作用进一步放大该应答。T3还差异性调节脂肪生成转录因子。虽然Pparg在所有脂肪细胞类型中表达，但T3选择性诱导棕色和米色脂肪细胞中Pparg表达并抑制白色脂肪细胞中表达。这种脂肪库特异性调控表明T3不仅激活产热基因，还根据代谢功能重塑脂肪生成和脂肪合成程序。4.4 脂解基因转录调控与功能性脂解之间的分离：去甲肾上腺素在有或无先前T3暴露的EB5和EB7脂肪细胞中均增加甘油释放，而T3单独未显著影响基础释放。这些结果表明持续T3暴露后去甲肾上腺素刺激的脂解得以保留，但未确定T3的增强作用。Pnpla2和Lipe转录水平不测量脂肪酶激活。这些基因未鉴定出经典TREs，提示可能的间接调控但不排除直接机制。肾上腺素能脂解涉及HSL和脂滴蛋白如perilipin的调控。由于未测量HSL磷酸化，观察到的应答背后的信号机制仍未解决。研究人员的数据突出了产热脂肪细胞中甲状腺激素和β-肾上腺素能信号之间的细胞类型特异性相互作用。虽然去甲肾上腺素在棕色（EB5）和米色（EB7）脂肪细胞中均强烈刺激脂解，但T3选择性增强棕色脂肪细胞中的该应答。相反，尽管具有强烈的β-肾上腺素能应答性，米色脂肪细胞在T3存在下未表现出脂解的进一步增强，提示该细胞类型中甲状腺激素信号与儿茶酚胺刺激的甘油三酯动员之间耦合有限。值得注意的是，T3单独未增加任一脂肪细胞类型的基础脂解，强化了甲状腺激素调节肾上腺素能应答性而非作为主要脂解信号的观点。在此框架内，数据揭示了T3对脂解基因的转录调控与功能性脂解之间的明显分离。T3对Pnpla2（ATGL）和Lipe（HSL）转录本仅产生轻微或无变化，而T3依赖性诱导的编码脂肪生成、氧化和产热程序的基因高度显著。这些观察表明ATGL和HSL作为上下文敏感的转录节点发挥作用，其表达取决于细胞状态而非甲状腺激素对其基因表达的直接作用，与这些基因中缺乏经典甲状腺激素应答元件一致。Ucp1的协调调控为这些观察提供了机制框架。虽然去甲肾上腺素单独在EB5和EB7脂肪细胞中诱导Ucp1表达，但T3和β-肾上腺素能刺激联合进一步放大该应答。这种协同作用支持T3增强脂解下游产热程序的概念，促进儿茶酚胺信号释放的脂肪酸氧化而非直接驱动其动员。在此背景下，T3似乎使脂肪细胞代谢偏向脂质摄取和氧化的有效耦合，特别是在棕色脂肪细胞中，同时将急性脂解控制留给交感神经输入。4.5 T3差异性调节葡萄糖和脂质代谢相关基因：T3在棕色和米色脂肪细胞中诱导协调的代谢程序，涵盖葡萄糖摄取、糖酵解和从头脂肪生成。T3增加EB5和EB7脂肪细胞中Slc2a4、Mlxipl、Gpd1和Fasn表达。在3T3-F442A脂肪细胞中，Slc2a4、Mlxipl和Gpd1降低，而Fasn保持不变。因此，这些结果确定了不同脂肪细胞类型之间的独特转录应答，突出了底物分配的基本分歧。在产热脂肪细胞中，葡萄糖摄取和脂肪生成可能支持甘油三酯周转和脂滴维持，这些过程日益被认为是持续UCP1依赖性产热所必需的。相反，白色脂肪细胞中这些途径的抑制与脂质储存减少一致。4.6 脂肪酸摄取和转运以及线粒体输入在产热脂肪细胞中被T3选择性增强：有效的产热需要持续的脂肪酸供应和线粒体输入。T3在棕色和米色脂肪细胞中上调Lpl、Cd36、Fabp4和Cpt1b，而在白色脂肪细胞中抑制或未能诱导这些基因。T3显著增加产热脂肪细胞中Lpl表达，EB5棕色细胞中诱导强于EB7米色细胞，而对F442A白色脂肪细胞无影响。线粒体输入水平的调控进一步由乙酰辅酶A羧化酶亚型控制：ACC1支持胞质脂肪酸合成，而ACC2（Acacb）在线粒体膜处产生丙二酰辅酶A，从而抑制CPT1b。所有脂肪细胞类型中Acacb的伴随抑制与丙二酰辅酶A介导的CPT1b抑制减少一致，促进线粒体脂肪酸氧化。总之，这些协调变化表明T3在产热脂肪细胞中促进有利于脂肪酸摄取、细胞内运输和线粒体氧化的脂质处理程序，从而支持持续的脂质利用而非储存。4.7 T3对MUFA合成的脂肪库特异性调控：脂质组成影响线粒体功能和产热效率。SCD1衍生的单不饱和脂肪酸如油酸和棕榈油酸支持产热和代谢健康，而饱和脂肪酸的积累促进脂毒性应激。数据显示T3在米色脂肪细胞中诱导Scd1表达，而在棕色和白色脂肪细胞中抑制其表达。这种选择性诱导提示米色脂肪细胞可能更依赖MUFA合成来维持产热活性并减轻饱和脂肪酸诱导的应激。4.8 T3调节脂肪因子表达和内分泌输出：瘦素和脂联素是调节能量平衡和代谢的关键脂肪因子，其失调促进肥胖和胰岛素抵抗。T3在所有脂肪细胞类型中下调Lep表达，并降低白色和棕色脂肪细胞中Adipoq表达，但不降低米色脂肪细胞中表达。鉴于这两个基因均不含经典甲状腺激素应答元件，抑制可能通过间接机制发生。总之，这些发现表明甲状腺激素在脂肪细胞中促进谱系特异性代谢程序，有助于在棕色和米色脂肪细胞中将脂质和碳水化合物代谢优先导向能量消耗，而白色脂肪细胞表现出更符合能量储存的独特应答。在本文使用的确定体外条件下，T3在棕色和米色脂肪细胞中促进产热基因程序，与增强的底物摄取和氧化途径相关，调节脂质代谢并影响脂肪因子表达，同时在白色脂肪细胞中引发产热取向较弱的应答。米色脂肪细胞成为特别敏感的细胞类型，将局部甲状腺激素信号与持续的产热基因表达联系起来。这些结果支持一个模型，其中甲状腺激素不仅通过中枢机制起作用，还通过脂肪细胞内在的、脂肪库特异性的代谢程序调控起作用。在此框架内，数据完善了对脂肪细胞功能内分泌控制的当前理解，并为未来旨在选择性调节代谢调控中甲状腺激素信号的研究提供了基础。研究结论翻译：这些发现表明，持续T3暴露引发脂肪细胞内在的、谱系依赖性的应答，并提示甲状腺激素有利于棕色和米色脂肪细胞中支持能量消耗的代谢程序，而在白色脂肪细胞中发挥更符合能量储存而非产热激活的独特效应。