小鼠骨髓源性巨噬细胞与硫乙醇酸盐诱导腹腔渗出巨噬细胞在产量、纯度、形态及脂多糖诱导细胞因子反应中的比较研究

《Autoimmunity》：Comparative study of yield, purity, morphology, and LPS-induced cytokine responses of BMDMs and thioglycollate-elicited PEMs

小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMDM）和小鼠腹腔巨噬细胞（PEM）是免疫学研究中最常用的原代细胞。目前缺乏这两种静息状态下模型的直接且完整的数据。本研究在一致的实验条件下，对BMDM和PEM的细胞产量、纯度、形态以及脂多糖（LPS）诱导的细胞因子分泌谱进行了比较。从同一批C57BL/6小鼠中取出股骨和胫骨，提取骨髓。BMDM用20 ng/mL的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）分化培养7天。给小鼠腹腔注射3%巯基乙酸盐培养基，3天后收集PEM。从第0天到静息成熟状态，测量每种细胞的形态变化。通过血球计数板和流式细胞术检测F4/80+CD11b+双阳性细胞来测定细胞产量。为了进行功能比较，用LPS刺激成熟的巨噬细胞，并在刺激后6小时、9小时和12小时通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定培养上清液中白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-12（IL-12）、白细胞介素-23（IL-23）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、趋化因子配体5（CCL5）、趋化因子配体9（CXCL9）和趋化因子配体16（CXCL16）的分泌水平。就大小和结构而言，成熟的BMDM呈细长纺锤形并形成连接。成熟的PEM通常呈圆形或椭圆形；部分细胞贴壁后呈多边形。净产量（[2.41 ± 1.79] × 107/只动物）和纯度（[96.93 ± 0.53]%）远高于PEM（[2.54 ± 0.15] × 106/只动物，[71.18 ± 0.83]%），且差异具有统计学意义。两种细胞的存活率均高于93%，两者之间无差异。在LPS刺激下，与BMDM相比，PEM在所有测量时间点分泌的IL-1β和IL-6水平显著更高，并且在12小时分泌的IL-23也显著更高（P < 0.0001）。BMDM产生了更多的IL-12（在9小时和12小时）和TNF-α（在所有时间点）。对于趋化因子，CXCL16在9小时时PEM中较高，而在12小时时BMDM中较高；而CXCL9仅在12小时时在BMDM中升高。CCL5在任何时间点在两种细胞类型间均无显著差异。其余的BMDM和PEM在大小、产量和纯度方面差异很大。它们在LPS刺激下也表现出不同的细胞因子和趋化因子反应模式。体外建模研究以不同方式应用它们。BMDM更适合用于需要大量靶标的实验，而PEM具有更短的成熟周期。在这两种模型之间的选择应同时考虑基线特征及其独特的功能反应谱。研究人员应选择最适合其实验限制条件的细胞模型。

论文解读文章

研究背景与目的

巨噬细胞是免疫系统中关键的效应细胞，负责应对病原体、触发炎症反应并维持组织稳态，因此成为免疫学研究的核心模型。在体外研究中，最常使用的两种巨噬细胞模型是小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMDM）和腹腔渗出巨噬细胞（PEM）。尽管两者都被广泛用于信号通路、吞噬作用、抗原呈递和药物筛选等研究，但它们是否可以互换使用一直存在争议。现有研究大多侧重于特定功能指标的差异，例如吞噬率、呼吸爆发和细胞因子分泌，并且报告了异质性，但缺乏在完全相同的实验条件下，对两种细胞基础特性（如产量、纯度、形态）的直接平行比较数据。此外，在受控刺激条件（如LPS诱导的细胞因子反应）下的功能性比较，也尚未在两种模型中充分并行表征。制备过程中的细节差异和实验环境的波动持续制约着细胞模型生成的成功率和可重复性。然而，这些基础特性是决定实验可行性和保真度的先决条件。因此，研究人员旨在同一客观条件下，同时从C57BL/6小鼠体内分离并培养BMDM和PEM，系统比较两种细胞从接种到成熟过程中的产量、纯度（F4/80⁺CD11b⁺）、活力及形态变化，并考察它们在LPS刺激后的细胞因子和趋化因子分泌谱，旨在为研究者提供基于数据的、高重复性的模型选择依据。

关键技术方法

1. 1.
   细胞分离与培养：研究人员从6-8周龄雄性SPF级C57BL/6小鼠中获取细胞。BMDM通过从股骨和胫骨中提取骨髓，并使用20 ng/mL重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）体外分化培养7天获得。PEM则通过向小鼠腹腔注射3%巯基乙酸盐培养基，3天后收集腹腔灌洗液获得。
2. 2.
   形态学观察：利用倒置相差显微镜在不同时间点动态观察两种细胞的形态变化。
3. 3.
   产量、活力和纯度检测：采用台盼蓝染色法测定细胞活力与总产量。使用流式细胞术，通过检测F4/80和CD11b双阳性细胞的比例来确定细胞纯度。
4. 4.
   功能比较：用100 ng/mL的脂多糖（LPS）刺激成熟的巨噬细胞，并在刺激后6、9和12小时收集培养上清液。使用商业化酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒定量检测多种细胞因子和趋化因子的浓度，包括白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、IL-12、IL-23、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、CCL5、CXCL9和CXCL16。
5. 5.
   统计分析：两组间差异采用独立样本t检验分析，多时间点比较采用单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey事后校正，显著性水平设定为P < 0.05。

研究结果

优化原代分离技术和改善培养条件

研究人员通过流程图展示了BMDM和PEM的分离、培养及优化工作流程，关键优化措施包括在冰上操作样本、定时乙醇消毒以及省略红细胞裂解步骤，以提高细胞活力和实验可重复性。

两种细胞类型的形态学特征

通过动态观察发现，成熟的BMDM呈现典型的细长梭形或星形，细胞体较大，有明显的突起，并相互连接形成疏松的网络。相比之下，刚接种的PEM多为圆形或椭圆形，但在贴壁培养12-24小时后，细胞体开始伸长并向外延伸，形成大量纤细的丝状伪足和树突状突起。

两种细胞类型的产量、活力和纯度比较

1. 1.
   产量：每只小鼠纯化BMDM的净产量为[2.41 ± 1.79] × 10⁷个，显著高于PEM的[2.54 ± 0.15] × 10⁶个（P < 0.05）。
2. 2.
   活力：两种细胞的活力均超过92%（BMDM: 95.75 ± 2.17%；PEM: 93.43 ± 2.6%），无统计学显著差异。
3. 3.
   纯度：BMDM中F4/80⁺CD11b⁺双阳性细胞的比例高达96.93 ± 0.53%，显著高于PEM的71.18 ± 0.83%（P < 0.05）。

LPS刺激后差异化的细胞因子和趋化因子分泌谱

在LPS刺激下，两种细胞表现出截然不同的反应模式：

1. 1.
   促炎细胞因子：PEM在所有三个时间点分泌的IL-1β和IL-6水平均显著高于BMDM（P < 0.0001）。此外，在12小时，PEM产生的IL-23也显著更多（P < 0.0001）。
2. 2.
   TNF-α和IL-12：相反，BMDM在所有时间点分泌的TNF-α水平显著更高（P < 0.01至P < 0.0001），并且在9小时和12小时产生的IL-12也显著多于PEM（P < 0.0001）。
3. 3.
   趋化因子：CXCL9仅在12小时时BMDM的水平显著高于PEM（P = 0.0314）。CXCL16的模式更为复杂：在9小时时PEM分泌更多（P = 0.0001），而在12小时时BMDM水平更高（P = 0.0016）。CCL5的分泌在两种细胞间无显著差异。

讨论与结论总结

讨论部分总结：讨论指出，BMDM和PEM在静息状态下的基础特性和功能反应上存在系统性差异，而非简单的优劣之分。BMDM因其更高的产量（约9.5倍）和纯度（>98%），更适用于需要同质细胞群的大规模实验，如转录组测序、蛋白质组学或高通量药物筛选。其细长的梭形形态可能与其更好的迁移和免疫监视能力有关。而PEM虽然纯度较低（约71%），但其制备周期短，且对LPS刺激表现出强烈的IL-1β和IL-6反应，这反映了其源自经常暴露于微生物的腹腔环境，更擅长启动急性局部炎症反应。BMDM则倾向于产生更高水平的TNF-α和IL-12，呈现出更接近经典活化（M1型）的表型，有利于辅助性T细胞1（Th1）极化和抗肿瘤免疫。这些功能差异源于它们不同的分化轨迹和生理微环境。因此，模型的选择不应仅基于产量或培养时间，更应考虑具体的研究目标：研究Th1型炎症反应或抗原呈递时，BMDM可能是首选；而研究涉及IL-1β和IL-6的急性炎症级联反应时，PEM可能更具生理相关性。

研究结论部分翻译：基于实验结果和上述讨论，BMDM和PEM之间的差异并非简单的孰优孰劣，而是反映了两种细胞类型在分化起源（体外M-CSF驱动 vs. 体内炎症微环境诱导）、成熟状态（前体分化 vs. 组织驻留成熟）和功能反应谱（BMDM：LPS刺激后较高的TNF-α/IL-12；PEM：强大的IL-1β/IL-6）上的根本差异。研究人员应根据其实验选择合适的细胞模型：BMDM的高纯度、高产量和Th1型细胞因子产生能力适用于信号转导研究、药物筛选和组学研究；而PEM的生理相关性及其快速的IL-1β/IL-6反应更适用于研究腹腔环境中的免疫调节、组织驻留巨噬细胞功能和免疫调节效应。每种模型都有其优势，合理选择并了解其局限性对于获得可靠结果至关重要。此外，直接的实验证据可用于指导体外巨噬细胞模型的决策。研究表明，静息状态的BMDM和PEM不可互换。静息BMDM产生更多细胞、纯度更高、呈梭形；PEM制备时间更短、纯度中等、贴壁2小时内呈椭圆形，12-24小时后贴壁生长并形成纤细丝状伪足和树突状突起。在LPS刺激后，BMDM分泌更高水平的TNF-α和IL-12，而PEM产生强大的IL-1β和IL-6，CXCL9和CXCL16的释放存在时间依赖性差异。研究人员应根据实验需求选择细胞来源：当需要大量高纯度巨噬细胞或Th1型功能读数时使用BMDM，当需要快速获取巨噬细胞或优先进行急性IL-1β/IL-6相关炎症研究时选择PEM。