优化囊泡运输组分与蛋白折叠因子的表达以进一步提升高产毕赤酵母中分泌型葡萄糖氧化酶的产量

《Biotechnology & Biotechnological Equipment》：Optimizing expression of vesicle trafficking components and protein folding factors to further enhance secretory glucose oxidase production in a hyperproducing Pichia pastoris

　　

葡萄糖氧化酶（GOD）是一种重要的氧化还原酶，广泛应用于食品、制药、生物燃料和环境工业。此前，研究人员通过优化蛋白特性、表达盒及囊泡运输蛋白EES和SEC22，构建了GOD高产菌株G1EeSe。然而，进一步提升GOD分泌仍面临挑战。本研究开发了一种有效策略，通过精细调控囊泡运输和蛋白折叠因子的表达来提升G1EeSe的GOD分泌。研究人员用多种启动子-终止子组合系统替换调控EES和SEC22的AOX1启动子和终止子，使胞外GOD产量提高16%，并减少了重复基因序列。对内质网（ER）输出因子和蛋白折叠基因的筛选鉴定出HAC1、JEM1和ERO1为GOD分泌的正调控因子。在P_ADH2启动子下的适度过表达比强P_FDH1启动子更有效。值得注意的是，在菌株G6-AERO中由P_ADH2驱动的ERO1过表达实现了摇瓶培养中最高的GOD产量——72,743.9 U/g DCW和625.5 U/mL——分别比G1EeSe提高1.5倍和1.4倍。这对应于通过半定量光密度法得出的约2.4 g/L的胞外GOD浓度。本研究为在高产酵母菌株中增强酶分泌提供了实用方法，并强调了在工程化蛋白折叠和运输时平衡基因表达的重要性。

**研究背景与意义**

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase, GOD; EC 1.1.3.4）催化β-D-葡萄糖氧化为D-葡萄糖酸-δ-内酯和过氧化氢，广泛应用于食品、纺织、制药、医学诊断和生物燃料等领域。为满足工业需求，研究人员通过优化GOD密码子、选择强启动子、增加基因拷贝数以及工程化蛋白折叠途径等策略，成功构建了高产重组毕赤酵母（*Pichia pastoris*）菌株。在此前的研究中，研究人员通过GOD饱和突变、使用内源信号肽Gas1、将GOD基因拷贝数增加至8个以及过表达内质网（endoplasmic reticulum, ER）至高尔基体囊泡运输组分EES和SEC22，构建了GOD高产菌株G1EeSe。该菌株在摇瓶培养中实现了49,065.2 U/g DCW和437.1 U/mL的分泌型GOD产量，在5 L生物反应器中达到79,383.4 U/g DCW、7223.0 U/mL和约30.7 g/L。然而，进一步提升G1EeSe的GOD产量面临更大挑战。

已有研究表明，辅助蛋白的共表达水平可能影响重组蛋白的分泌和表达效率。例如，在酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）中，中等强度启动子P_TEF1驱动Sec16过表达比强启动子P_GPD更有效地增强蛋白分泌。在G1EeSe中，强启动子P_AOX1被用于驱动EES和SEC22的表达，但囊泡运输组分的过度过表达可能造成代谢负担并损害分泌型GOD的表达。此外，8拷贝GOD基因表达盒的构建也使用了相同的P_AOX1启动子和AOX1转录终止子（AOXtt）。在工程化毕赤酵母中，重复基因序列易在体内触发环出重组，导致部分表达盒丢失并影响基因型稳定性。因此，用不同强度和类型的启动子与终止子组合替换G1EeSe中EES和SEC22表达盒的P_AOX1-AOXtt，可能进一步提高GOD产量并减少重复序列和遗传不稳定性。

此外，研究人员观察到G1EeSe的胞内GOD活性仍然较高，暗示蛋白运输特别是ER输出可能仍是限速步骤。与Ees和Sec22类似，Emp24、Erv25、Erp1、Erv29和Sed5也参与ER输出。其中，p24家族成员Emp24、Erv25和Erp1促进ER输出，ER跨膜受体蛋白Erv29增强蛋白高效包装进入囊泡并促进其离开ER，可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE）Sed5的功能与Sec22类似。ER蛋白折叠和成熟通常被认为是毕赤酵母中异源蛋白分泌生产的限速步骤，在高产菌株中，重组蛋白的高效分泌表达往往需要增强蛋白折叠效率。Hac1和Ero1常被靶向用于增强蛋白折叠，RNase Ire1负责将HAC1前体mRNA剪接为成熟形式，Lhs1和Jem1作为分子伴侣促进蛋白正确折叠。因此，在高产菌株中进一步上调这些参与ER输出和蛋白折叠途径的基因可能显著促进分泌型GOD产量。

**主要技术方法**

本研究采用的主要技术方法包括：（1）构建多种启动子-终止子组合（P_DAS2、P_DAS1、P_GAP与RPS2tt、TDH3tt）通过同源重组替换G1EeSe中EES和SEC22表达盒的调控元件，经菌落PCR验证单拷贝整合；（2）从UniProt、NCBI和KEGG数据库鉴定毕赤酵母同源基因，在48深孔板中筛选5个ER输出因子和5个蛋白折叠因子的过表达效果；（3）利用强启动子P_FDH1和中等强度启动子P_ADH2分别驱动HAC1、JEM1和ERO1过表达，通过摇瓶培养评估生长和GOD产量；（4）采用邻联茴香胺-辣根过氧化物酶法测定GOD活性，以DCW归一化计算比活性；（5）通过SDS-PAGE和光密度分析半定量胞外GOD蛋白浓度；（6）采用qRT-PCR（以GAPDH为内参基因，2^?ΔΔCt法）测定GOD、ERO1和HAC1的转录水平。统计采用双尾Student's *t*检验，*p* < 0.05视为显著。

**研究结果**

**替换G1EeSe中EES和SEC22表达盒的P_AOX1-AOXtt以提高GOD产量。** 研究人员选取3种启动子（P_DAS2、P_DAS1、P_GAP）和2种终止子（RPS2tt、TDH3tt）设计了6种组合，通过同源重组在ENO位点替换EES和SEC22的表达盒。摇瓶培养结果显示，各菌株生长差异不大，但胞外GOD产量差异显著。最优菌株G1EeSe-6（P_GAP-EES-RPS2tt+P_DAS1-SEC22-TDH3tt）在诱导144 h后胞外GOD比活性达56,908.9 U/g DCW，为对照菌株G1EeSe（49,065.2 U/g DCW）的116%。相反，G1EeSe-1（P_DAS2-EES-RPS2tt+P_DAS1-SEC22-TDH3tt）的胞外比活性最低，仅为对照的49%。胞内GOD测定显示，G1EeSe-6的胞内和总GOD产量最高，分别达18,830.4和75,739.3 U/g DCW，分泌比提高至0.75（对照为0.72）。因此，研究人员选择G1EeSe-6进行后续研究。

**工程化G1EeSe-6的ER输出和蛋白折叠。** 研究人员选取5个ER输出相关靶点和5个蛋白折叠相关靶点，用强启动子P_FDH1在G1EeSe-6中逐一过表达，在48深孔板中评估其对GOD分泌的影响。结果显示，过表达5个ER输出基因均降低了胞外GOD比活性，尤其是SED5。在蛋白折叠基因中，过表达HAC1和JEM1提高了胞外GOD比活性，诱导24 h后相对比活性分别达203%和133%，诱导48 h后分别为133%和126%；过表达ERO1在诱导48 h后将相对比活性提高至105%。随后，研究人员在摇瓶中培养共表达菌株G6-FHAC、G6-FJEM和G6-FERO。结果显示，过表达HAC1和JEM1在诱导前120 h降低了DCW，但在诱导前72 h内显著提高了胞外GOD比活性；72 h后G6-FHAC的比活性增长显著放缓。过表达ERO1对生长影响较小，诱导144 h后胞外GOD比活性达对照的105%。这些结果表明，HAC1和JEM1过表达在诱导初期显著增强胞外GOD产量，但随着诱导进程效果逐渐减弱，而ERO1共表达的增强效果在整个诱导期内相对有限。

**利用ADH2启动子适度过表达HAC1、JEM1和ERO1改善G1EeSe-6的GOD分泌产量。** P_FDH1是强度与P_AOX1相当的强诱导型启动子，而P_ADH2在以甲醇为碳源时强度约为P_FDH1的50%。研究人员用P_ADH2替换P_FDH1驱动HAC1、JEM1和ERO1表达，通过同源重组将表达盒整合至RGI2位点，构建了G6-AHAC、G6-AJEM和G6-AERO菌株。与强启动子P_FDH1不同，中等启动子P_ADH2驱动这三个基因过表达不损害宿主菌株生长，同时增强胞外GOD产量。诱导144 h后，G6-AERO、G6-AHAC和G6-AJEM的胞外GOD比活性分别达72,743.9、67,744.2和60,953.0 U/g DCW，分别为对照G1EeSe-6（56,908.9 U/g DCW）的128%、119%和107%。胞内GOD测定显示，与强启动子P_FDH1相比，中等启动子P_ADH2获得了更高的胞内和胞外酶活性及总GOD产量。G6-AERO和G6-AHAC的总产量分别达94,894.5和83,064.0 U/g DCW，分别为对照的125%和110%。与P_FDH1相比，P_ADH2驱动ERO1适度过表达使胞外GOD产量相对于胞内产量的增幅更大，从而提高了分泌比；而HAC1和JEM1的适度过表达则使胞内产量增幅更大，导致分泌比下降。SDS-PAGE分析显示，G6-AERO的GOD蛋白条带强度最高，其次为G6-AHAC、G1EeSe-6、G6-FERO和G6-FHAC。光密度分析表明，G6-AERO、G6-AHAC、G6-FERO、G6-FHAC和对照G1EeSe-6的GOD浓度分别约为2.4、2.2、1.8、1.2和1.7 g/L，与胞外GOD比活性结果一致。此外，G6-AERO和G6-AHAC培养上清中其他蛋白较少，GOD为主要蛋白，有利于下游纯化。qRT-PCR结果显示，共表达菌株中ERO1和HAC1转录水平显著升高，证实过表达成功；P_FDH1驱动的ERO1和HAC1转录水平约为P_ADH2驱动的2.0倍，表明弱启动子有效实现了下调。过表达HAC1和ERO1不影响GOD转录水平，表明GOD产量的提高并非源于GOD转录上调，而可归因于ERO1或HAC1的适度上调。

**讨论与结论**

本研究通过设计多种启动子-终止子组合替换G1EeSe中EES和SEC22表达盒的P_AOX1-AOXtt序列，优化了囊泡运输组分的表达水平并避免了P_AOX1和AOXtt序列重复导致的潜在遗传不稳定性。在6种组合中，最佳组合GAP-EES-RPS2tt+DAS1-SEC22-TDH3tt对应菌株G1EeSe-6。此外，在10个参与ER输出和蛋白折叠的过表达靶点中，HAC1、ERO1和JEM1被鉴定为提高G1EeSe-6中GOD产量的正调控因子。使用中等强度P_ADH2适度过表达这三个基因比强启动子更有利于GOD产量。ERO1适度过表达菌株G6-AERO实现了最高GOD产量，胞外蛋白浓度约2.4 g/L，GOD活性625.5 U/mL。与亲本菌株G1EeSe相比，G6-AERO的最大胞外GOD活性和比活性分别提高1.4倍和1.5倍，为迄今报道的最高分泌型GOD表达水平。此外，由于基因组中重复序列减少，G6-AERO较G1EeSe具有更好的遗传稳定性，经发酵工艺优化后具有更大的工业规模化生产潜力。研究人员指出，在工程化宿主蛋白折叠和分泌时，应考虑过表达靶点的表达强度和时机；HAC1过表达在诱导后期可能导致ERAD过度激活从而降低GOD产量，因此通过过表达HAC1工程化蛋白折叠时需考虑宿主菌株基因型和HAC1的广泛转录调控。本研究通过优化囊泡运输组分EES和SEC22以及ER折叠因子ERO1、HAC1和JEM1的表达，进一步提高了GOD高产菌株G1EeSe的GOD产量，获得的G6-AERO菌株在摇瓶培养中实现了迄今最高的分泌型GOD表达水平，并具有减少基因组重复序列的优势，具备更大的工业规模化生产潜力。