《Antioxidants》：Salvianolic Acid B Alleviates Lipopolysaccharide-Induced Intestinal Barrier Dysfunction by Restoring Epithelial Proliferation–Apoptosis Balance and Modulating the Gut Microbiota
编辑推荐：
摘要
背景：肠上皮屏障功能障碍是炎症和氧化应激的主要后果之一，可促进肠道疾病进展。丹酚酸B（Salvianolic acid B, SAB）是丹参（Salvia miltiorrhiza）中一种重要的水溶性酚类化合物，显示出肠道保护潜力，但其潜在机制尚不明确。
摘要
背景：肠上皮屏障功能障碍是炎症和氧化应激的主要后果之一，可促进肠道疾病进展。丹酚酸B（Salvianolic acid B, SAB）是丹参（Salvia miltiorrhiza）中一种重要的水溶性酚类化合物，显示出肠道保护潜力，但其潜在机制尚不明确。方法：本研究利用脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）攻击的仔猪模型和LPS刺激的IPEC-J2细胞，探讨了SAB对肠道屏障功能的保护作用。结果：SAB减轻了LPS诱导的肠道损伤，表现为血浆二胺氧化酶（diamine oxidase, DAO）和D-乳酸水平降低、肠道形态改善、促炎细胞因子减少以及抗氧化能力增强。SAB还通过增加杯状细胞数量和黏蛋白2（mucin 2）水平以及上调紧密连接蛋白表达，增强了肠道屏障完整性。此外，SAB恢复了肠上皮增殖-凋亡平衡并增加了PI3K/AKT/mTOR磷酸化。分子对接和分子动力学模拟预测了稳定的SAB-PI3Kα/p110α相互作用，而LY294002处理减弱了SAB介导的LPS处理IPEC-J2细胞中上皮更新和屏障完整性的恢复。SAB还改变了空肠微生物组成，包括Streptococcus相对丰度升高和Escherichia-Shigella相对丰度降低，同时伴随空肠乙酸盐和乳酸盐浓度升高。结论：SAB通过恢复肠上皮增殖-凋亡平衡以及调节微生物群-代谢物谱，减轻了与炎症相关的肠道屏障功能障碍。
一、研究背景与目的
肠上皮屏障功能障碍是炎症性肠病、感染性肠炎等多种肠道疾病的标志性病理特征。上皮完整性的丧失会增加黏膜暴露于管腔抗原、微生物产物及有害代谢物，从而加剧局部炎症和组织损伤。氧化应激常伴随肠道炎症发生，可通过压倒内源性抗氧化防御并促进脂质过氧化进一步损害上皮屏障功能。因此，寻找有助于维持上皮稳态的植物源生物活性化合物，可能是在炎症应激下保护肠道屏障功能的有效策略。肠上皮的完整性不仅依赖于完整的细胞间连接，还依赖于沿隐窝-绒毛轴的持续上皮更新。在生理条件下，上皮增殖与凋亡受到严格调控，而炎症应激会打破这种平衡，导致上皮更新受损、绒毛萎缩和屏障功能障碍。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路是细胞生长、存活、代谢和组织修复的核心调控枢纽，其失调与多种肠道损伤模型中上皮更新缺陷和黏膜修复延迟有关。同时，肠道菌群通过定植抵抗、黏膜免疫调节及产生短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs）等微生物代谢物参与肠道稳态维持。肠道炎症常伴随菌群失调和代谢物改变，这可能进一步破坏上皮和黏膜稳态。因此，协同维持上皮更新和肠道微生物稳态对于保护肠道屏障功能和促进黏膜恢复至关重要。
丹酚酸B（Salvianolic acid B, SAB）是丹参中的主要水溶性酚类化合物，具有抗氧化、抗炎和细胞保护特性。已有研究表明SAB可通过抑制TLR4/MyD88/MAPK级联、调节NF-κB RelA活性及抑制NF-κB/NLRP3信号等多种机制减轻炎症损伤，并能改善实验性结肠炎和肠道缺血再灌注损伤。然而，SAB肠道保护作用的机制尚未完全阐明，特别是其在炎症相关肠道屏障损伤中是否能恢复上皮增殖-凋亡平衡并调节肠道菌群及相关代谢物仍不清楚。
二、研究方法
本研究采用脂多糖（LPS）攻击的断奶仔猪模型（每组6只，共18只雄性杜长大三元杂交仔猪，初始体重10.26±0.24 kg）和LPS刺激的猪肠上皮细胞系（IPEC-J2细胞）进行体内外实验。关键技术方法包括：组织学和免疫荧光染色（苏木精-伊红染色、阿尔新蓝-过碘酸雪夫染色、Ki67和TUNEL染色）、跨上皮电阻（TEER）测量和荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖（FD4）通透性测定评估屏障功能、流式细胞术检测细胞凋亡、EdU增殖实验、蛋白质印迹法检测蛋白磷酸化水平、分子对接和分子动力学（MD）模拟预测SAB与PI3Kα/p110α的相互作用、16S rRNA基因测序分析空肠菌群组成、气相色谱和高效液相色谱测定短链脂肪酸（SCFAs）和乳酸盐浓度。
三、研究结果
3.1 SAB缓解LPS攻击仔猪的肠道屏障损伤
与对照组相比，LPS攻击组仔猪血浆二胺氧化酶（DAO）活性和D-乳酸浓度显著升高，空肠组织学结构明显破坏（绒毛萎缩、上皮细胞脱落、黏膜水肿），组织病理学损伤评分升高，绒毛高度（VH）和VH/隐窝深度（CD）比值降低，杯状细胞数量、黏蛋白2（mucin 2）水平以及闭锁蛋白（occludin）和紧密连接蛋白-1（ZO-1）荧光强度均下降。SAB补充降低了血浆DAO活性和D-乳酸浓度，改善了空肠黏膜结构，降低了组织病理学损伤评分，恢复了VH，并增加了杯状细胞数量、黏蛋白2水平以及occludin和ZO-1荧光强度。
3.2 SAB减轻LPS攻击仔猪的空肠炎症并改善抗氧化状态
LPS攻击显著提高了空肠黏膜肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）浓度，降低了超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性，增加了丙二醛（MDA）含量。SAB补充显著抑制了TNF-α和IL-1β的过度产生，恢复了SOD和GPX活性，并降低了MDA含量。
3.3 SAB恢复LPS攻击仔猪空肠上皮增殖-凋亡平衡
LPS攻击显著抑制了上皮增殖并引发了广泛凋亡，表现为Ki67阳性细胞急剧减少、TUNEL阳性细胞大量增加，同时下调了增殖标志物增殖细胞核抗原（PCNA）和细胞周期蛋白D1（CCND1）以及抗凋亡基因B细胞淋巴瘤-2（BCL2）的mRNA表达，上调了促凋亡基因BCL2相关X蛋白（BAX）的表达。SAB部分逆转了这些变化，增加了Ki67阳性细胞，减少了TUNEL阳性细胞，并恢复了PCNA、BCL2和BAX的表达。
3.4 SAB恢复LPS攻击仔猪空肠PI3K/AKT/mTOR磷酸化
LPS攻击抑制了空肠中PI3K、AKT和mTOR的磷酸化。SAB补充有效恢复了它们的磷酸化水平。
3.5 LY294002处理削弱SAB在LPS刺激IPEC-J2细胞中介导的上皮保护
在IPEC-J2细胞中，LPS刺激降低了PI3K、AKT和mTOR磷酸化，破坏了上皮屏障完整性（TEER降低、FD4通透性增加），诱导了促炎细胞因子mRNA表达上调，减少了EdU阳性细胞，提高了凋亡率，并下调了occludin和ZO-1蛋白表达。SAB处理显著逆转了这些LPS诱导的变化。PI3K抑制剂LY294002预处理显著削弱了SAB对这些参数的影响。
3.6 分子对接和MD模拟表征预测的SAB-PI3Kα/p110α相互作用
分子对接预测SAB可与PI3Kα/p110α结合，AutoDock Vina得分为-8.015 kcal/mol，通过六个氢键、两个盐桥和疏水相互作用稳定。100纳秒MD模拟显示复合物构象稳定，MM/GBSA计算结合自由能为-43.92±3.82 kcal/mol，范德华力和静电相互作用是主要贡献因素。
3.7 SAB改变LPS攻击仔猪的空肠微生物群和代谢物谱
16S rRNA基因测序显示，LPS攻击增加了空肠菌群α多样性指数（Sobs、Chao、Ace、Shannon），降低了Simpson指数，SAB未显著逆转这些变化。主坐标分析（PCoA）和Adonis分析表明各组间菌群结构存在显著差异。LPS降低了厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度，增加了变形菌门（Proteobacteria）相对丰度；SAB则逆转了这些变化。在属水平，LPS降低了Streptococcus丰度，增加了Escherichia-Shigella、Romboutsia、Terrisporobacter和Dietzia丰度；SAB增加了Streptococcus和Clostridium_sensu_stricto_6丰度，降低了Escherichia-Shigella、Enterobacter和Actinobacillus丰度。线性判别分析效应大小（LEfSe）分析进一步区分了各组的微生物特征。代谢物方面，LPS降低了总SCFAs、乙酸盐、丙酸盐和乳酸盐浓度，SAB显著增加了总SCFAs、乙酸盐和乳酸盐水平。
3.8 空肠微生物群、代谢物与肠道屏障参数之间的关联
Spearman相关性分析显示，Streptococcus丰度与乙酸盐、乳酸盐和总SCFAs呈正相关，与上皮增殖正相关，与血浆D-乳酸、上皮凋亡和空肠TNF-α水平负相关。Escherichia-Shigella和Enterobacter丰度则呈现相反的关联模式。
四、讨论与结论
讨论部分指出，SAB通过恢复PI3K/AKT/mTOR信号通路相关的上皮增殖-凋亡平衡以及重塑空肠微生物群-代谢物谱，减轻了LPS诱导的空肠屏障功能障碍、形态破坏和炎症。SAB增强了紧密连接蛋白表达和黏液屏障，可能减少上皮暴露于管腔抗原从而限制黏膜炎症放大。SAB对PI3K/AKT/mTOR通路的激活作用与在其他实验环境中的发现一致，LY294002的药理学抑制作用进一步支持了该通路参与SAB介导的上皮保护。分子对接和MD模拟为SAB与PI3Kα/p110α的相互作用提供了结构假设。SAB并未简单地将单个LPS响应性分类群正常化，而是介导了空肠微生物群落的更广泛重组，其中Streptococcus和Escherichia-Shigella的变化与代谢物和上皮状态的协调变化相关联。尽管猪与人小肠微生物群存在一定分类学重叠，但该研究无法确定两者微生物多样性和相对丰度的定量可比性。
研究结论： SAB减轻了LPS诱导的肠道炎症和屏障损伤，并恢复了上皮增殖-凋亡平衡，药理学抑制实验支持PI3K/AKT/mTOR参与这些效应。SAB还改变了空肠微生物群和代谢物谱，表现为厚壁菌门（Firmicutes）和Streptococcus相对丰度升高，变形菌门（Proteobacteria）和Escherichia-Shigella相对丰度降低，以及乙酸盐和乳酸盐浓度升高。总之，这些发现支持SAB作为一种植物源膳食生物活性化合物在炎症应激下保护肠道屏障功能的潜力。
