基于fit-derived phasor分析的阿尔茨海默病脑内皮细胞功能障碍代谢特征研究：一项概念验证研究

《Biosensors》：Fit-Derived Phasor Analysis of Metabolic Signatures of Cerebral Endothelial Dysfunction in Alzheimer’s Disease: A Proof-of-Concept Study

　　

脑内皮细胞（CECs）层面的血管功能障碍是阿尔茨海默病（AD）发病机制的早期组成部分。荧光寿命成像显微镜（FLIM）结合phasor分析可基于NAD(P)H自发荧光实现细胞代谢的无标记评估。本概念验证研究旨在评估FLIM结合fit-derived phasor分析在比较来源于健康供体和阿尔茨海默病（AD）患者的脑内皮细胞（CECs）以及表征其对代谢调节剂反应方面的潜力。CECs由来源于健康供体（PO2）和AD患者（Alz9L，APP V717I突变）的诱导多能干细胞分化而来。在基础条件下以及使用3-氯-5-羟基苯甲酸（3CLBA）和乳酸钠处理后进行双光子NAD(P)H FLIM。分析包括平均寿命（τ_mean）、相位寿命（τ_φ）、双指数拟合参数以及由这些参数重建的phasor坐标。在基础条件下，尽管平均NAD(P)H寿命相似，PO2和Alz9L细胞的phasor分布存在显著差异。Alz9L细胞表现出较低的τ_φ和较高的短寿命组分寿命τ₁。乳酸钠处理后，Alz9L细胞表现出比PO2细胞更高的a₁/a₂比值以及更低的τ_mean和τ₁值。基础状态与乳酸处理后状态的比较显示Alz9L细胞中τ_mean和τ₁显著降低。Fit-derived phasor分析可联合可视化拟合的NAD(P)H衰减参数，并揭示所研究的两种CEC细胞系之间的差异，尽管其基础平均寿命相似。这些概念验证观察结果需要在来自独立供体的额外细胞系中进行验证。

研究背景方面，血管异常目前被认为是阿尔茨海默病（AD）发病机制的重要组成部分，而非仅仅是神经退行性变的后果。尸检显示大多数AD患者存在大血管改变和微血管病变，这些过程导致脑血流减少并可能通过促进β-淀粉样蛋白和tau蛋白积累诱导神经退行性改变。根据AD的"二次打击血管假说"，初始血管损伤包括低灌注和血脑屏障（BBB）破坏，创造了加速淀粉样蛋白和tau病理的条件，进而进一步损害脑微循环，建立神经退行性变的恶性循环。神经血管单元（NVU）在其中发挥核心作用，NVU功能障碍增加BBB通透性、破坏脑微循环并减少β-淀粉样蛋白清除。脑内皮细胞（CECs）因此作为病理过程的早期靶点特别受关注。CECs具有维持BBB功能所需的特化特性，包括紧密连接蛋白高表达、低水平窗孔和转胞吞作用、广泛的膜转运蛋白系统以及高代谢活性。内皮能量代谢与内皮功能状态密切相关，在神经退行性变过程中CECs的结构和功能异常伴随细胞代谢变化，但这些变化的性质及精确检测方法仍理解不足。内皮-间质转化（EndMT）作为衰老和中枢神经系统疾病中血管特化表型丧失的机制日益受到关注，EndMT与阿尔茨海默神经退行性变的关联在内皮代谢重编程背景下具有额外意义。乳酸是脑内皮功能的重要代谢和信号调节因子，通过单羧酸转运体和GPR81受体参与NVU内的细胞间代谢交换。来源于人诱导多能干细胞（iPSCs）的细胞模型对此类研究特别有前景。荧光寿命成像显微镜（FLIM）可基于NAD(P)H自发荧光实现细胞代谢的无标记分析。Phasor表示法将荧光衰减动力学映射到由坐标G和S定义的二维空间。然而，FLIM在表征AD患者来源CECs的NAD(P)H依赖表型及其对代谢调节剂反应方面的潜力仍未充分探索。本研究旨在评估来源于健康供体（PO2）和AD患者（Alz9L）iPSCs的CECs在NAD(P)H依赖FLIM表型上的差异，并表征乳酸钠和GPR81受体激动剂3CLBA诱导的变化。研究人员开展了以下研究并得出相应结论：通过双指数衰减拟合结合fit-derived phasor表示，在基础条件下发现两种细胞系的fit-derived phasor分布存在差异，尽管平均NAD(P)H荧光寿命相似；Alz9L细胞表现出较低的τ_φ和较高的τ₁；3CLBA处理后两种细胞系的phasor分布大幅重叠；乳酸钠处理后Alz9L细胞中τ_mean、τ₁和τ₂降低。这些发现表明多组分NAD(P)H荧光衰减结构的变化在仅分析平均荧光寿命时可能未被检测到。该研究的重要意义在于提供了概念验证证据，证明NAD(P)H依赖FLIM可表征两种iPSC来源CEC细胞系之间的差异，该方法的价值在于联合解释拟合的衰减参数及其在代谢扰动后的变化。

研究人员用到的主要关键技术方法包括：使用双光子FLIM系统（集成TCSPC模块和混合光电探测器）在730 nm激发下记录NAD(P)H自发荧光衰减；采用最大似然估计（MLE）结合IRF重卷积进行双指数荧光衰减拟合；基于双指数拟合参数计算分数强度和phasor坐标（G和S）进行fit-derived phasor分析；使用Mahalanobis距离量化phasor坐标空间中细胞组的分离程度，并采用Hotelling's T2检验和多变量置换检验评估统计显著性；使用Mann-Whitney U检验进行FLIM参数的组间两两比较。样本队列来源：Alz9L细胞系来源于携带APP基因V717I突变（伦敦突变）的AD患者，PO2细胞系来源于表观健康供体，均为俄罗斯科学院西伯利亚分院细胞与遗传研究所和洛普欣物理化学医学联邦研究与临床中心先前建立并表征的iPSC系。

研究结果方面：（1）免疫细胞化学染色——iPSC分化的细胞表达CD31、CD146、CLDN5和GPR81，表明保留了内皮特化能力；PDGFRβ的存在显示潜在的血管周围/间充质特征和表型异质性，可能提示培养物中发生内皮-间质样转化（EndMT-like）；AD患者来源培养物中PDGFRβ表达强度降低。（2）细胞外乳酸水平和血管生成活性评估——基础条件下Alz9L细胞中蛋白归一化的细胞外乳酸水平比PO2低26.5%；3CLBA处理后PO2乳酸水平降低41.8%，Alz9L降低17.2%；AD患者来源的球体在刺激后表现出比健康供体更高的血管生成活性。（3）PO2和Alz9L细胞系的NAD(P)H依赖FLIM表型评估——基础条件下两种细胞系均显示明显的细胞内NAD(P)H自发荧光寿命分布异质性；fit-derived phasor分布不同，Alz9L phasor云向较高G和较低S值偏移，Mahalanobis距离DM=1.52，Hotelling's检验和置换检验均得出名义细胞水平p值<0.001；τ_mean在健康细胞中为0.67±0.07 ns，在AD细胞中为0.68±0.07 ns，基本不变；Alz9L细胞中τ_φ较低（1.08±0.10 ns vs 1.21±0.06 ns，p<0.001），τ₁较高（0.31±0.06 ns vs 0.23±0.04 ns，p<0.001）；a₁/a₂比值在AD细胞中为3.41±1.39，健康细胞中为2.56±0.44（p=0.054）。3CLBA处理后，两种细胞系的fit-derived phasor分布大幅重叠（DM=0.21），Hotelling's检验和置换检验名义p值均高于0.85；健康细胞中3CLBA处理使τ₁从0.23±0.04增至0.30±0.06 ns，τ_mean和a₁/a₂比值增加；AD细胞中τ₁从0.31±0.06降至0.25±0.07 ns，τ_φ从1.08±0.10增至1.22±0.11 ns。乳酸钠处理后，AD细胞中τ_mean较低（0.55±0.04 ns vs 0.68±0.07 ns，p<0.001），a₁/a₂比值较高（3.01±0.41 vs 2.16±0.67，p=0.001），τ₁较低（0.18±0.03 ns vs 0.22±0.04 ns，p=0.013），τ_φ无显著差异；fit-derived phasor分布间DM=0.99，Hotelling's检验p=0.045，置换检验p=0.412；AD细胞中乳酸钠处理使τ_mean从0.68±0.07降至0.55±0.04 ns，τ₁从0.31±0.06降至0.18±0.03 ns。对于长寿命组分τ₂，组间比较在基础条件下p=0.36，3CLBA处理后p=0.67，乳酸钠处理后p=0.95；组内比较显示PO2细胞中3CLBA处理后τ₂增加，Alz9L细胞中乳酸钠处理后τ₂降低。

讨论部分总结：本概念验证研究使用双指数衰减拟合和fit-derived phasor表示鉴定了两种iPSC来源CEC细胞系PO2和Alz9L之间NAD(P)H依赖FLIM表型的差异。基础条件下，尽管平均NAD(P)H荧光寿命相似，fit-derived phasor分布在探索性细胞水平比较中存在差异。相似的τ_mean值伴随Alz9L细胞中较低的τ_φ和较高的τ₁，a₁/a₂比值和短寿命组分幅度仅显示上升趋势。这种组合表明细胞系之间的差异不能用平均寿命变化方向或游离与酶结合NAD(P)H的明确重新分布来描述。短寿命和长寿命组分仅主要与游离和酶结合NAD(P)H相关，其寿命还取决于局部微环境、区室化、与不同酶的结合、pH和其他物理化学因素。本分析中NADH和NADPH贡献未分离，测量的自发荧光被解释为联合NAD(P)H信号。τ_mean和τ_φ之间的区别说明同一拟合衰减的不同汇总可强调其形状的不同方面。3CLBA处理后fit-derived phasor分布大幅重叠，细胞系间比较在两种检验中均未达到名义显著性阈值。乳酸钠处理后，PO2和Alz9L之间的探索性细胞水平比较对τ_mean、a₁/a₂和τ₁得出名义p值低于0.05，而τ_φ和τ₂的比较未达到该阈值。研究人员指出该研究存在若干局限性：记录的自发荧光代表NADH和NADPH的联合信号；研究使用来自单一健康对照系和单一AD患者来源系的细胞；FLIM统计检验未考虑细胞在视野和培养孔中的嵌套聚类；phasor坐标和τ_φ来源于双指数拟合参数因此继承拟合程序的假设和不确定性；研究的血管细胞来源于共同的中胚层/血管祖细胞池，需要定量面板区分内皮特化和周细胞谱系。尽管存在这些局限性，研究结果提供了概念验证证据，证明NAD(P)H依赖FLIM可表征两种iPSC来源CEC细胞系之间的差异。研究结论部分翻译如下：本概念验证研究使用双指数拟合和fit-derived phasor分析表征了来源于一个健康供体（PO2）和一个AD患者（Alz9L）的CECs的NAD(P)H依赖表型。在基础条件下，尽管平均寿命（τ_mean）相似，细胞系在fit-derived phasor特征、相位寿命（τ_φ）和短寿命组分寿命（τ₁）方面存在差异。这表明当仅分析平均荧光寿命时，多组分NAD(P)H荧光衰减结构的变化可能未被检测到。3CLBA和乳酸钠处理与多个FLIM参数的组内变化相关。3CLBA处理后，fit-derived phasor分布大幅重叠，而τ₁在PO2细胞中增加、在Alz9L细胞中降低。乳酸钠处理后，Alz9L细胞中τ_mean、τ₁和τ₂降低。这些观察描述了每种细胞系内的变化；细胞系间处理效应的差异未被正式检验。这些发现应被视为概念验证，因为研究使用了来自一个健康供体对照系和一个AD患者来源系的iPSC来源细胞，且记录的自发荧光代表NADH和NADPH的联合贡献。需要在额外的独立细胞系中进行验证并与内皮和AD相关表型的分子和功能特征进行比较，以确定所鉴定的FLIM特征的可重复性和生物学特异性。总体而言，双指数拟合结合fit-derived phasor表示为研究所用iPSC来源血管细胞模型中NAD(P)H依赖荧光提供了无标记方法。该方法支持联合解释拟合的寿命和幅度及其在代谢调节后的变化。这些FLIM特征与内皮身份、EndMT样可塑性和血管生成功能的关系是一个有前景的假设，需要定量表型和功能验证。