《Biosensors》：Comparison of Lateral Flow Immunoassays with Gold Nanoparticles of Different Shapes for Simultaneous Detection of Two Triazole Fungicides in Fruits and Berries
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研究人员开发了一种侧向流免疫层析法（LFIA），用于同时检测水果与浆果中的两种三唑类杀菌剂——环丙唑醇（cyproconazole）与苯醚甲环唑（difenoconazole）。该检测采用间接竞争模式，并以两种金纳米颗粒（金纳米球与金纳米花）作为标记物。选择灵
研究人员开发了一种侧向流免疫层析法（LFIA），用于同时检测水果与浆果中的两种三唑类杀菌剂——环丙唑醇（cyproconazole）与苯醚甲环唑（difenoconazole）。该检测采用间接竞争模式，并以两种金纳米颗粒（金纳米球与金纳米花）作为标记物。选择灵敏度更高的金纳米花（GNFs）检测体系后，环丙唑醇的目视检出限与仪器检出限分别为0.6 ng/mL和0.01–0.02 ng/mL，苯醚甲环唑分别为4 ng/mL和0.20–0.75 ng/mL。该检测已成功应用于李子、蔓越莓和樱桃提取物，环丙唑醇的回收率为91%–113%，苯醚甲环唑的回收率为92%–119%。
一、研究背景与问题
食品安全是公共卫生与经济可持续发展的关键决定因素。三唑类杀菌剂是应用最广泛的一类内吸性农药，其中环丙唑醇与苯醚甲环唑在谷物、水果、蔬菜和浆果作物保护中大量使用。两者的最大残留限量（MRLs）依据欧盟法规（EC）No 396/2005 设定，因产品类型不同可相差一个数量级以上；环丙唑醇已于2021年在欧盟被禁用，但进口商品仍受监管，浆果作物受到的限量要求尤为严格。长期膳食暴露于这些农药残留可导致肝与内分泌功能紊乱、代谢异常、生殖系统损伤及累积毒性，过量施用还会污染土壤与水生生态系统。传统实验室方法准确性高，但耗时数小时至数天、样品前处理复杂、需多阶段分析且劳动强度大。侧向流免疫层析法（LFIA）可在无需专用设备与复杂前处理的条件下现场检测，平均分析时间15–20 min，非专业人员亦可操作，多参数配置还可显著降低分析时间与成本。LFIA最常用的标记物是金纳米球（GNSs），而金纳米花（GNFs）因粒径更大、表面更发达，具有更高吸附容量，有利于抗体固定与分析信号放大，其优势此前已在夹心法模式中得到验证；但在竞争性LFIA中，大粒径颗粒表面的高抗体密度可能削弱竞争结合效率，从而降低分析性能。间接标记方案可将样品中特异性抗体与分析物的竞争反应，与膜上半抗原–蛋白偶联物的结合过程分开，使标记物浓度可独立调节并延长抗原–抗体特异性相互作用时间，但该策略此前主要在采用球形金纳米颗粒的单参数LFIA中得到验证，其与金纳米花在多参数竞争性LFIA中的适用性几乎未被探索。本研究首次将金纳米花间接标记LFIA与仪器判读相结合，用于环丙唑醇与苯醚甲环唑的定量同时测定。
二、研究内容与结论
研究人员合成了GNSs与GNFs并对其进行表征，在间接抗体标记方案下将二者作为LFIA标记物进行比较，建立并优化了单参数与多参数检测体系，最终在水果与浆果样品中实现两种目标分析物的同时检测，并考察了基质效应、回收率与选择性。结论为：基于GNFs的间接标记结合仪器信号读取，是提升竞争性多参数LFIA分析性能的有效策略，所建方法可满足苯醚甲环唑在水果与浆果产品中MRL监测的法规要求；对环丙唑醇，目视判读可用于识别高污染样品，而超过MRL的浓度检测需借助仪器判读。该工作为低分子量分析物的多参数测定提供了初步验证，后续需纳入真实污染样品、与独立参考方法比对，并对含两种目标物不同浓度与比例的混合物进行定量分析。
三、关键技术方法
研究采用柠檬酸钠还原法（Frens法）合成金纳米球，采用金种子介导生长法在氢醌与柠檬酸钠存在下合成金纳米花；以透射电子显微镜（TEM）与动态光散射（DLS）表征颗粒形貌与流体力学直径；将抗物种抗体与两类纳米颗粒按相同方案偶联；以自动点膜仪在工作硝酸纤维素膜上固定半抗原–蛋白偶联物构建检测线，组装并切割成试纸条；采用间接竞争LFIA模式，以平板扫描仪采集试纸条图像并用图像分析软件计算检测线显色强度，以四参数Sigmoid函数拟合浓度依赖曲线，按3σ准则计算仪器检出限。样品为李子、蔓越莓与樱桃，经匀浆、甲醇–水（80:20，v/v）提取、离心、减压去溶剂、复溶后以工作缓冲液稀释20倍使用，农药标准品在稀释后加入。
四、研究结果
3.1 纳米颗粒表征：通过TEM与DLS表征，GNSs平均直径为19.72 nm（n=250，最小11.43 nm，最大23.55 nm），椭圆度1.23±0.04；以直径11.53 nm的金核生长得到的GNFs平均直径为53–76 nm，呈高度各向异性。DLS测得GNSs与GNFs的流体力学直径分别为22.47 nm与70.4 nm，与TEM结果的差异源于水化层贡献。
3.2 LFIA模式确定：通过间接竞争方案，样品中加入特异性抗体，检测区固定半抗原–蛋白偶联物，以金纳米颗粒–抗物种抗体偶联物检测游离抗体–抗原免疫复合物；样品中农药超过阈值时与特异性抗体结合，阻止其与固定抗原形成复合物，从而不产生显色条带。
3.3 基于GNSs与GNFs的单参数LFIA优化：通过改变样品中特异性抗体浓度与纳米颗粒偶联物中抗物种抗体浓度，得出显色强度与二者浓度呈正相关。GNSs体系选定抗环丙唑醇抗体250 ng/mL、抗苯醚甲环唑抗体500 ng/mL；GNFs体系选定抗物种抗体10 μg/mL，抗环丙唑醇与抗苯醚甲环唑抗体分别为250 ng/mL与1000 ng/mL。GNSs体系下环丙唑醇目视检出限为56 ng/mL，超过MRL（10 ng/mL）5.6倍；抗体浓度提高至400 ng/mL时显色强度增加两倍，目视检出限为18.5 ng/mL，仍约为法规值的两倍；苯醚甲环唑目视检出限为12 ng/mL。GNFs体系下环丙唑醇与苯醚甲环唑检出限分别为167 ng/mL与111 ng/mL。
3.4 基于GNSs与GNFs的多参数LFIA优化：通过改变特异性抗体浓度、检测区半抗原–蛋白偶联物浓度及检测区固定顺序进行优化，发现LFIA灵敏度依赖检测区在膜上的位置顺序；苯醚甲环唑的免疫反应化学平衡较环丙唑醇更快达到，故将苯醚甲环唑–BSA偶联物固定在靠近工作膜起始位置处。GNSs体系最终得到环丙唑醇目视与仪器检出限167 ng/mL与6.7 ng/mL（IC50 16.94 ng/mL，工作范围6.8–42.5 ng/mL），苯醚甲环唑为12 ng/mL与4.7 ng/mL（IC50 8.91 ng/mL，工作范围4.7–16.7 ng/mL）。GNFs体系最终选定抗环丙唑醇与抗苯醚甲环唑抗体浓度100 ng/mL与500 ng/mL、半抗原–蛋白浓度0.2与0.5 mg/mL，得到环丙唑醇目视0.6 ng/mL、仪器0.03 ng/mL（IC50 0.21 ng/mL，工作范围0.04–1.1 ng/mL），苯醚甲环唑目视4 ng/mL、仪器1.1 ng/mL（IC50 2.04 ng/mL，工作范围1.2–4.4 ng/mL）。结果表明在优化条件下GNFs作为标记物可获得更低检出限。
3.5 多参数LFIA的应用验证：在匀浆李子、蔓越莓与樱桃提取物中检测目标物。2、4、10倍稀释时液流通过困难、颗粒滞留于起始区并造成整片红或紫色染色，20倍稀释为最优，可保证工作膜最小染色与所需提取液黏度。加标回收结果显示，环丙唑醇回收率为91%–113%，苯醚甲环唑为92%–119%；作者指出重复测量的变异性应在定量结果解释中予以考虑，定量估计应基于至少三次独立重复LFIA测量的均值并报告相应标准差，回收结果说明均值与加标水平一致，但不应视为单次测量高精密度的证据。
3.6 选择性测试：考察第1组（多菌灵、敌草隆、联苯菊酯、高效氯氟氰菊酯、百草枯、毒死蜱）与第2组（粉唑醇、戊唑醇、灭菌唑、丙环唑、戊菌唑、环丙唑醇、苯醚甲环唑）农药，各以300 ng/mL加入含抗体与GNFs–GAMI偶联物的样品；加入目标物（第1组选择性测定为150 ng/mL，第2组为50 ng/mL）时检测区不显色，无目标物时显色强度与PBS空白一致，表明所建体系仅在目标分析物与其抗体间发生特异性结合。
3.7 与其他LFIA的比较：针对目标分析物的已发表LFIA极少，且均基于球形金纳米颗粒并用于不同食品基质。苯醚甲环唑方面，Liu等人在黄瓜与梨样品中实现目视与仪器检出限5 μg/kg与2.3–2.6 μg/kg，Wang等人报道柑橘样品目视检出限200 μg/kg；本研究在水果与浆果基质中实现目视与仪器检出限80 μg/kg与16–42 μg/kg，并可同时多残留测定。环丙唑醇方面，Liu等人近期在 rice、番茄与葡萄样品中实现10–50 μg/kg检出限；本研究多参数体系在李、蔓越莓与樱桃样品中实现目视检出限12 μg/kg、仪器检出限0.4–2 μg/kg，在提高灵敏度的同时将LFIA拓展至两种三唑类杀菌剂的单次同时测定。由于分析物在提取后加入，以μg/kg表示的检出限由提取物数据结合稀释倍数、样品质量与提取液体积换算得到。
五、讨论与结论
研究结论指出，研究人员建立了一种用于快速同时测定水果与浆果前处理样品中三唑类杀菌剂环丙唑醇与苯醚甲环唑的多参数LFIA；在优化条件下，基于金纳米花的LFIA对环丙唑醇的目视检出限为0.6 ng/mL、苯醚甲环唑为4 ng/mL，仪器检出限分别达0.01–0.02 ng/mL与0.20–0.75 ng/mL，这些分析特性满足苯醚甲环唑在水果与浆果产品中MRL监测的法规要求；对环丙唑醇，目视评估可识别高污染水平样品，而检测超过既定MRL的环丙唑醇浓度需仪器判读。研究结果证实，将间接标记与金纳米花相结合并配合仪器信号记录，是增强竞争性多参数LFIA分析性能的有前景策略；该方法展示了基于GNFs与间接标记的LFIA用于低分子量分析物多参数测定的潜力，属于初步验证。后续工作应纳入真实污染样品、与独立参考方法进行比较，并对含两种目标分析物不同浓度与比例的混合物开展定量分析。
