《Biosensors》：Development and Application of Two Modes of Immunochromatographic Assay Strips for Vanillin Rapid Detection in Food Products
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香兰素（vanillin）作为食品风味添加剂的不当使用构成潜在威胁，因此对其进行有效监管至关重要。快速生物传感是现有检测方法的有益补充或替代策略。研究人员分别组装了基于金纳米颗粒（GNP）和荧光微球（FMP）标记抗香兰素单克隆抗体的两种模式免疫层析检测（ICA
香兰素（vanillin）作为食品风味添加剂的不当使用构成潜在威胁，因此对其进行有效监管至关重要。快速生物传感是现有检测方法的有益补充或替代策略。研究人员分别组装了基于金纳米颗粒（GNP）和荧光微球（FMP）标记抗香兰素单克隆抗体的两种模式免疫层析检测（ICA）试纸条，获得GICA试纸条和FICA试纸条用于香兰素的检测。试纸条的比色/荧光信号可直接由裸眼判读进行半定量，随后通过试纸条读取仪进行数字化定量。GICA的线性范围为15.6–500 ng/mL，检出限（LOD）为10.3 ng/mL。FICA试纸条通过增强的灵敏度实现了低至2.04 ng/mL的LOD值，线性范围为3.12 ng/mL至200 ng/mL，较GICA试纸条提高了5倍。两种模式的ICA试纸条在10 min内对香兰素的现场检测均具有高特异性、稳定性、准确度和精密度。对于真实食品样品中的香兰素水平，其结果与参比ELISA和HPLC方法的测量结果具有良好的相关性。结果表明，两种模式的ICA试纸条能够实现对食品中香兰素的快速、灵敏、现场、半定量和定量检测，最终保障食品安全和消费者健康。
研究背景方面，香兰素（4-羟基-3-甲氧基苯甲醛）是全球产量最大的高档广谱风味化合物，约50%的全球总产量用作食品添加剂，广泛应用于饮料、巧克力、乳制品等食品类别。截至2019年全球年消费量约20000吨，中国作为全球最大生产国约占全球总产量的70%。长期过量及不当摄入香兰素可能引起头痛、恶心、呕吐等急性不良症状，甚至导致肝肾功能损伤和味觉依赖，尤其对婴幼儿群体危害更大。近期调查发现多种食品中存在反复超限量和超范围使用香兰素的违规现象。JECFA设定了香兰素0–10 mg/kg体重的ADI值，美国FDA规定饮料、巧克力等一般食品类别中香兰素最大允许使用量为100 mg/kg，中国国家标准进一步规定婴幼儿辅助食品中香兰素最大授权水平不超过50 mg/kg，并严格禁止在0–6月龄婴儿配方食品中添加香兰素。目前香兰素的检测主要依赖色谱类方法，如HPLC、UPLC、HPLC-MS/MS等，虽然具有优越的灵敏度和检测准确性，但仪器成本高、检测效率有限。免疫分析以快速、低成本和高通量筛选著称，免疫层析检测（ICA）因便携性和可读性在现场检测中受到广泛关注。已有研究建立了基于量子点微球的多重ICA用于同时检测食品样品中的香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素。本研究旨在建立香兰素快速ICA试纸条，通过裸眼识别进行半定量检测，并通过数字化试纸条读取仪进行定量检测，以满足食品安全监管的迫切需求。
研究人员开展了两种模式ICA试纸条的开发与应用研究。分别将金纳米颗粒（GNP）和荧光微球（FMP）整合到ICA中，组装了基于GNP的ICA（GICA）和基于FMP的ICA（FICA），分别反映比色/荧光信号。使用便携式试纸条读取仪计数比色/荧光信号的T/C值，增强了统计检测的便利性和香兰素的数字化定量能力。两种开发的ICA试纸条成功应用于功能性饮料和配方乳粉等食品样品中。研究得出，GICA模式的LOD值为10.3 ng/mL，FICA模式的LOD值低至2.04 ng/mL，灵敏度较GICA提高了5倍。两种模式ICA试纸条在10 min内均具有高特异性、稳定性、准确度和精密度，与参比ELISA和HPLC方法的结果具有良好的相关性。该研究的重要意义在于，开发的ICA试纸条将显著提高香兰素现场检测的简便性、快速性和便携性，可为食品风味添加剂标准化监管提供坚实的技术支撑，保障食品安全和消费者健康。
在关键技术方法方面，研究人员通过柠檬酸三钠还原HAuCl?合成GNP，基于亲水吸附作用制备香兰素–McAb–GNP探针；采用NHS/EDC方法基于FMP羧基与McAb氨基的化学结合制备香兰素–McAb–FMP探针；将包被抗原和GAM-IgG分别预喷于NC膜上作为T线和C线，组装成宽度4.0 mm的试纸条；检测在室温下7 min内完成，通过裸眼和便携式试纸条读取仪分别进行半定量和定量判读；采用交叉反应率（CR）试验评价特异性，并在室温储存60天内评估稳定性；通过加标回收试验和真实样品检测验证可靠性，真实样品来源于当地超市，结果与ELISA和HPLC方法进行相关性评价。
研究结果方面，在vanillin–McAb和探针鉴定中，通过ELISA程序评估vanillin–McAb性能，基于ELISA校准曲线，LOD值达到1.0 ng/mL，线性检测范围为1.0–500 ng/mL，保证了ICA试纸条开发的有效性。TEM图像显示GNP均匀分散，平均直径为21.3 nm；UV-vis吸收光谱显示vanillin–McAb–GNP探针在525 nm处较GNP的520 nm吸收峰发生显著红移，表明探针成功制备。FMP平均直径为210.5 nm，vanillin–McAb–FMP探针的激发波长（Ex）和发射波长（Em）分别为360 nm和610 nm，用于后续光学信号检测。
在关键参数优化中，通过对两种模式ICA试纸条参数的优化有效提高了检测灵敏度和性能。GNP溶液pH通过K?CO?用量评估，最佳体积为3.5 μL；vanillin–McAb–GNP探针的最佳McAb浓度为2.0 mg/mL；GICA的NC膜包被抗原和GAM-IgG浓度分别为0.25 mg/mL和0.10 mg/mL；Tween-20最佳用量为0.08%，甲醇最佳用量为5.0%。FICA方面，sulfo-NHS:EDC最佳比例为1.3:1，vanillin–McAb浓度为1.6 mg/mL，包被抗原和GAM-IgG分别为0.18 mg/mL和0.07 mg/mL，Tween-20为0.08%，甲醇为5.0%。
在灵敏度方面，GICA试纸条的红色信号随香兰素水平增加逐渐褪去直至消失，裸眼LOD为15.6 ng/mL，T线完全抑制出现在500 ng/mL，半定量分类为阴性（<15.6 ng/mL）、弱阳性（15.6–500 ng/mL）和阳性（≥500 ng/mL）。定量检测中，T/C值与香兰素水平的对数在15.6–500 ng/mL范围内呈显著负相关，线性方程为Y = ?0.5707 LgX + 1.6192（R2 = 0.9933），LOD为10.3 ng/mL。FICA模式下，荧光信号随香兰素水平增加逐渐降低，半定量分类为阴性（<3.12 ng/mL）、弱阳性（3.12–200 ng/mL）和阳性（≥200 ng/mL），标准曲线为Y = ?1.5064 LgX + 3.4407（R2 = 0.9945），线性范围3.12–200 ng/mL，LOD为2.04 ng/mL，较GICA模式灵敏度提高5倍。FICA模式因FMP材料具有高荧光强度、窄发射峰和优异光稳定性的优势而展现出更有前景的性能。与色谱仪器方法约30 min和传统ELISA约150 min的多步操作相比，所提出的两种模式ICA试纸条更简便、高效、低成本，不需要昂贵仪器和专业操作人员。
在特异性和稳定性方面，交叉反应试验显示GICA对阿魏酸的CR值为11.7%，其他类似物均小于0.1%；FICA对阿魏酸的CR值为11.2%，其他类似物均小于0.1%，表明开发的ICA试纸条对目标香兰素识别具有高选择性和特异性。稳定性试验中，GICA在0 ng/mL时T/C值为1.21–1.26，200 ng/mL时为0.293–0.306，SD值为0.009–0.016；FICA在0 ng/mL时T/C值为4.06–4.19，100 ng/mL时为0.327–0.393，SD值为0.026–0.085，表明两种模式ICA试纸条具有优异的重复性和稳定性。
在准确性和适用性方面，加标回收试验中GICA模式的平均回收率为88.4%–103.6%，RSD值为2.07%–9.08%（n = 3）；FICA模式的回收率为84.2%–97.7%，RSD值为2.40%–11.6%。真实样品检测中，半定量检测显示阴性、弱阳性和阳性样品分别为4、1和6个。GICA模式检测的香兰素水平范围为2105–32424 ng/mL（或ng/g），FICA模式为2213–31258 ng/mL（或ng/g），与参比ELISA和HPLC方法结果高度相关，验证了两种ICA试纸条的可靠性和实用性。AGREE评估得分为0.82。
讨论部分总结了两种模式ICA试纸条通过将高亲和力香兰素–McAb与便捷的比色/荧光信号放大整合到经典试纸条平台上，实现了直观视觉判读和试纸条读取仪定量的快速现场检测。灵敏度从GICA到FICA逐步提升，可根据不同情况选择性使用。与已报道方法相比，灵敏度值更优或接近，足以满足食品中香兰素的最大允许使用水平。未来研究应持续关注特定基质效应偏差和极端环境下的储存稳定性等挑战。研究结论部分翻译如下：为进一步保障食品产品安全并增强香兰素检测能力，开发了两种模式ICA试纸条用于香兰素检测，并应用于功能性饮料和配方乳粉样品。在10 min内，ICA试纸条的比色/荧光信号可通过裸眼直接判读进行快速半定量检测，并通过试纸条读取仪进行数字化精确量化检测。香兰素检测范围为3.12–500 ng/mL，GICA模式的LOD值为10.3 ng/mL，FICA模式的LOD值为2.04 ng/mL。与基于微板的ELISA和基于色谱仪器的HPLC方法相比，开发的ICA方法显著缩短了总体分析时间和检测流程。两种模式ICA试纸条的特异性、稳定性、准确度和精密度均非常好。开发的ICA方法在食品样品中的应用和相关性进一步验证了其检测真实样品中香兰素的可靠性和实用性。总体而言，携带纳米颗粒反映两种信号模式的快速ICA平台实现了半定量和定量检测，在改善食品中香兰素监测和增强监管效率方面具有广阔的应用前景。
