《Pharmaceutics》：Development and Validation of a Multianalyte LC-MS/MS Method for Quantification of BRAF and MEK Inhibitors and Cannabidiol in Cell Lysates and Cell Culture Media
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背景：BRAF抑制剂和MEK抑制剂是黑色素瘤的既定靶向治疗药物，常以联合方案给药（达拉非尼/曲美替尼、恩考拉非尼/比美替尼和维莫非尼/考比替尼）。非精神活性植物大麻素大麻二酚（CBD）目前正作为潜在抗癌化合物进行研究。由于CBD可能与靶向抗癌治疗联合使用，其对
背景：BRAF抑制剂和MEK抑制剂是黑色素瘤的既定靶向治疗药物，常以联合方案给药（达拉非尼/曲美替尼、恩考拉非尼/比美替尼和维莫非尼/考比替尼）。非精神活性植物大麻素大麻二酚（CBD）目前正作为潜在抗癌化合物进行研究。由于CBD可能与靶向抗癌治疗联合使用，其对细胞内药物暴露的潜在影响需要进一步研究。方法：参考ICH M10指南的相关原则，开发并验证了一种快速、灵敏的LC-MS/MS方法，用于同时定量细胞裂解液和细胞培养基中的三种BRAF抑制剂、三种MEK抑制剂和CBD。该方法应用于测定A375黑色素瘤细胞在单药和联合治疗后的细胞内药物水平。结果：该方法在所评估的验证参数（包括选择性、校准性能、精密度、准确度、回收率和稳定性）方面表现出稳健的分析性能，并在适用情况下符合预定义的接受标准。由于在无蛋白水溶液中表观分析物回收率有限，最可能原因是亲脂性化合物的非特异性表面吸附，因此加入1%（w/v）牛血清白蛋白用于分析物稳定化。将该方法应用于A375黑色素瘤细胞，能够可靠地检测蛋白质归一化细胞相关分析物水平的治疗依赖性变化。结论：该验证的LC-MS/MS方法能够可靠地同时定量细胞模型中的BRAF抑制剂、MEK抑制剂和CBD。它为研究细胞内药物浓度以及影响细胞内药物水平的潜在药物-药物相互作用提供了有价值的工具。
研究背景方面，黑色素瘤因高转移潜力和相关死亡率而成为最具侵袭性的皮肤癌之一。约40–66%的黑色素瘤存在激活型BRAF突变，其中BRAF V600E最为常见，该突变导致RAS–RAF–MEK–ERK信号级联组成性激活，促进肿瘤细胞增殖和存活。因此，BRAF和MEK双重抑制成为BRAF V600突变的黑色素瘤的既定治疗策略，三种已确立的BRAF/MEK抑制剂联合方案包括达拉非尼/曲美替尼、恩考拉非尼/比美替尼和维莫非尼/考比替尼，均较BRAF抑制剂单药治疗改善无进展生存期。然而，治疗耐药和疾病进展仍是主要临床挑战，促使研究者探索大麻素等潜在抗癌药物。临床前研究表明大麻素可调节肿瘤细胞增殖、侵袭、血管生成和存活，并可诱导多种癌症模型中的凋亡和自噬。在黑色素瘤和皮肤鳞状细胞癌细胞中，Δ9-四氢大麻酚（THC）和CBD可诱导线粒体功能障碍和凋亡，表明其具有直接细胞毒性作用。大麻素正日益与癌症治疗联合使用，引发了对可能影响临床疗效的药物-药物相互作用的担忧。在包括黑色素瘤在内的晚期恶性肿瘤患者中，合并使用大麻与免疫检查点抑制剂纳武利尤单抗的应答率降低相关。此外，黑色素瘤细胞系的临床前研究显示CBD与顺铂之间存在拮抗相互作用。鉴于大麻素、BRAF抑制剂和MEK抑制剂均为药物转运蛋白P-糖蛋白（P-gp）和乳腺癌耐药蛋白（BCRP）的底物和/或抑制剂，转运蛋白介导的药物-药物相互作用可能影响细胞内药物暴露。然而，目前尚无分析方法能够同时测定三种已确立的BRAF/MEK抑制剂组合和CBD。因此，研究人员开发并验证了一种快速、灵敏且稳健的LC-MS/MS方法，用于同时定量细胞裂解液和细胞培养基中的三种BRAF抑制剂、三种MEK抑制剂和CBD，并将其应用于A375黑色素瘤细胞中细胞内药物水平的测定。该研究的重要意义在于为研究细胞内药物浓度及影响细胞内药物水平的潜在药物-药物相互作用提供了有价值的分析工具。
在关键技术方法方面，研究人员采用液相-液萃取（乙酸乙酯）进行样品前处理，以反相C18柱（Multospher? 120 RP18 AQ）结合梯度洗脱进行色谱分离，采用正离子多反应监测（MRM）模式进行质谱检测，并使用同位素标记内标（IS）进行定量校正。方法验证参照ICH M10指南的相关原则进行。细胞模型方面，使用A375人黑色素瘤细胞系（RRID: CVCL_0132）、A431细胞系（RRID: CVCL_0037）和A2058细胞系（RRID: CVCL_1059），其中A431和A2058仅用于分析验证实验以评估选择性和基质效应。细胞培养实验中，A375细胞以3 × 10
5细胞/孔接种于六孔板，处理后在无血清DMEM中孵育24 h。细胞内分析物水平以蛋白质归一化细胞相关分析物含量（nmol/mg蛋白质）表示。
研究结果方面，方法开发部分：研究目的是建立灵敏度足以检测细胞培养实验中所有化合物且样品制备尽可能简单的方法。蛋白沉淀（甲醇或乙腈）灵敏度不令人满意，因此评估了液–液萃取作为替代方案。最适萃取条件为100 μL样品用500 μL乙酸乙酯萃取，不添加酸性或碱性添加剂。在该条件下，BRAF和MEK抑制剂的回收率约为75–98%，CBD约为63–70%，且重复性良好（CV < 15%）。色谱条件评估了多种固定相，最终选择RP18相，七种分析物在7 min内检测完成，另需4 min系统再平衡。方法开发中的主要挑战涉及化合物的表观稳定性：初步冻融分析显示除比美替尼和达拉非尼外所有化合物下降超过20%。鉴于所有化合物均较亲脂，研究人员假设分析物吸附至微量管表面是低回收率的原因，通过加入BSA成功改善了稳定性。方法验证部分：校准曲线方面，所有分析物的校准曲线均符合接受标准，至少七个校准品的计算准确度为85–115%（LLOQ为80–120%），R
2值不低于0.993。准确度和精密度方面，最高CV为曲美替尼LLOQ的批内精密度（18.93%），仍符合验证方案要求；其他所有分析物所有浓度水平的CV均低于15%。批内平均准确度为88.67–111.65%，批间平均准确度为92.16–107.83%。选择性方面，在空白样品或仅加同位素标记IS的样品中未观察到分析物保留时间处的相关干扰，六种不同基质中干扰峰面积均低于LLOQ样品的20%，IS通道干扰低于5%。残留方面，空白样品中分析物峰面积低于LLOQ样品的9%，IS峰面积不超过LLOQ样品的0.19%。基质效应方面，所有研究基质中准确度（85–115%）和精密度（<15% CV）均符合预定义接受标准。稀释完整性方面，平均准确度为91.62%（CBD）至111.50%（恩考拉非尼），CV不超过6.31%。稳定性方面，分析物稳定性相对于初始测量浓度为86.93–111.47%，精密度不超过14.43%；最低稳定性为CBD高QC水平的长期稳定性（?20 °C，3个月，平均稳定性86.93%），仍高于85%阈值。再进样重现性方面，准确度为89.08–108.41%，精密度不超过14.61% CV。回收率方面，BRAF和MEK抑制剂回收率约为75–98%，CBD较低（约63–70%），但所有浓度水平均重复性良好（CV < 15%）。细胞内浓度测定部分：在A375细胞中，临床使用的BRAF/MEK抑制剂联合方案在较高处理浓度（10 μM BRAF抑制剂、1 μM MEK抑制剂）下，除恩考拉非尼外所有化合物均呈现细胞内浓度增加的趋势，但结果变异性较高，无预先定义的比较达到统计学显著性。在较低处理浓度（1 μM BRAF抑制剂、0.1 μM MEK抑制剂）下未发现一致趋势。CBD（3 μM）共处理对BRAF和MEK抑制剂细胞内浓度的影响方面，达拉非尼、恩考拉非尼、维莫非尼和曲美替尼呈现细胞内浓度增加趋势，比美替尼保持不变，考比替尼呈现下降趋势；仅达拉非尼在CBD共处理后细胞内浓度显著增加，考比替尼显著降低。BRAF/MEK抑制剂联合方案对CBD细胞内积累的影响方面，与各BRAF/MEK抑制剂联合方案共处理后，细胞内CBD浓度均增加。
讨论部分总结：验证的分析工作流程能够准确、精密地定量细胞内药物浓度。研究选择水相细胞裂解方案是因为该方案能够从同一样品中同时测定细胞内药物浓度和总蛋白质含量，从而避免需要平行细胞培养。然而，考虑到多种BRAF和MEK抑制剂的显著亲脂性，不能排除使用有机溶剂的替代细胞裂解方案可能获得更高的绝对分析物回收率。因此，所报告的细胞内浓度应在所应用样品制备方案的背景下解读。由于所有样品处理方式相同，所获得的数据仍支持实验条件间细胞内药物水平的可靠比较评估。结论部分翻译：开发并验证了一种LC-MS/MS方法，用于同时定量细胞裂解液和细胞培养基中临床使用的BRAF抑制剂达拉非尼、恩考拉非尼和维莫非尼，MEK抑制剂曲美替尼、比美替尼和考比替尼，以及植物大麻素CBD。向Tris缓冲液中加入1%（w/v）BSA可最大程度减少水溶液中表观分析物损失，最可能通过减少非特异性表面吸附实现。该方法证明了其用于A375细胞细胞处置研究的适用性。最突出的发现是，与CBD单药相比，各BRAF/MEK抑制剂联合方案共处理后细胞内CBD浓度显著增加。CBD共处理还使相应BRAF/MEK抑制剂联合方案中达拉非尼的细胞内浓度增加、考比替尼的细胞内浓度降低。对于单独的BRAF/MEK抑制剂联合方案，仅在较高处理浓度下观察到几种抑制剂细胞内浓度较相应单药治疗增加的趋势。需要进一步系统研究，包括扩展浓度范围和增大样本量。总体而言，该方法为未来的细胞处置和相互作用研究提供了稳健的分析平台。
